霍亂弧菌LysR家族基因vc2324及其調(diào)控基因vc2323功能的研究.pdf

1、烈性傳染病霍亂由革蘭氏陰性細菌霍亂弧菌所引起，該細菌主要毒力基因CTXΦ和VPI（霍亂弧菌毒力島）受AphB-ToxR級聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控，該系統(tǒng)中LysR家族基因aphB直接調(diào)控霍亂弧菌毒力基因的表達。LysR家族基因廣泛存在于細菌各種屬中，為原核生物中目前已知最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，其調(diào)控的基因功能多樣，涉及合成代謝、群體感應(yīng)、毒力等眾多方面。目前發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌基因組中約有40個LysR型基因，其中大多尚未被研究。
　　 本文選取其中

2、4個未被研究的LysR型基因分別構(gòu)建其缺失突變株，通過比較突變株與野生株在定殖能力、毒力、生物膜形成能力等方面的差異，發(fā)現(xiàn)了一個參與霍亂弧菌定殖的LysR型基因vc2324。檢測其相鄰上游基因vc2323的轉(zhuǎn)錄情況，證實vc2324正調(diào)控vc2323的轉(zhuǎn)錄。宿主腸道競爭定殖實驗發(fā)現(xiàn)vc2323缺失株定殖能力顯著下降且較vc2324下降幅度更大。結(jié)合LysR家族基因經(jīng)典調(diào)控模式，推測vc2323為影響霍亂弧菌定殖的功能基因。
　　

3、 蛋白質(zhì)同源性分析發(fā)現(xiàn)，假設(shè)蛋白VC2323與大腸桿菌中碲抗性蛋白TehA、流感嗜血桿菌HiTehA和擬南芥中SLAC1通道蛋白屬于同源蛋白，推測該蛋白可能具有亞碲酸鹽抗性、多重耐藥性等多種功能。通過TcpA western blot和tcpA轉(zhuǎn)錄水平的檢測，發(fā)現(xiàn)vc2323、vc2324均不影響霍亂弧菌毒力蛋白TCP的表達和形成。檢測不同物質(zhì)對vc2323表達的影響，并比較vc2323缺失株和野生株對KNO2、H2O2的敏感性差異，發(fā)

4、現(xiàn)CO2/HCO3-不影響vc2323的表達，vc2323與霍亂弧菌NO/NO2-抗性、活性氧抗性無明顯關(guān)系。同時還發(fā)現(xiàn)vc2323、vc2324均不影響霍亂弧菌在LB培養(yǎng)基中生物膜的形成，也與霍亂弧菌對H+耐受力無關(guān)。
　　 體外競爭黏附實驗發(fā)現(xiàn):粗膽鹽存在時，vc2323缺失株較野生株對小鼠小腸的黏附力明顯下降，且隨黏附時間的延長差異更加顯著;而當無粗膽鹽存在時，二者對腸道的黏附力無明顯差異。且體外實驗表明，野生株與vc23

5、23缺失株對粗膽鹽的敏感性相同。綜合以上結(jié)果，分析vc2323對霍亂弧菌定殖能力的影響可能是因為在粗膽鹽存在時其能夠影響霍亂弧菌對宿主腸道的黏附能力，進而導(dǎo)致vc2323缺失株較野生株定殖能力顯著下降，詳細的分子機制尚待更深入的研究。
　　 同時，比較不同抗菌物質(zhì)對缺失株與野生株最小殺菌濃度的差異，發(fā)現(xiàn)vc2323缺失株對氯霉素和萘啶酮酸的耐受性分別下降了約64％和74％，對亞碲酸鉀的抗性下降了約33％，表明vc2323還參與霍