奇異變形桿菌波動生長相關(guān)蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、背景：奇異變形桿菌是一種條件致病菌，但是在過去一個多世紀(jì)以來，奇異變形桿菌卻以它顯著的同心環(huán)生長模式和細(xì)胞二態(tài)性吸引著大量科學(xué)家的探索，而目前國內(nèi)外研究者主要針對單一細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行某些蛋白表達(dá)的研究，探討的應(yīng)用也是純粹的微生物學(xué)專業(yè)內(nèi)容的探討，未見以之作為模型，聯(lián)系復(fù)雜系統(tǒng)探索的工作。
　　本室已歷時20年，完成大量的前期工作，包括菌株、pH、瓊脂含量、接種方式等對波動生長的影響，本研究擬探索波動過程中基因調(diào)控的變化，以奇異變形桿菌

2、形態(tài)學(xué)研究為基礎(chǔ)，將其生長期分為5個階段，分別提取其蛋白進(jìn)行篩選及驗證，將環(huán)境與機(jī)制探索結(jié)合，為探明波動生長機(jī)制奠定一定得基礎(chǔ)。
　　方法：首先在培養(yǎng)基中加入呼吸酶指示劑—2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，環(huán)上細(xì)菌逐漸變?yōu)榧t色，但是這種改變與環(huán)的形成不具有同步性，而相對滯后。根據(jù)這一現(xiàn)象，將奇異變形桿菌分為5個生長階段:遷徙階段、鞏固階段環(huán)上及環(huán)間細(xì)菌、變紅階段環(huán)上及環(huán)外細(xì)菌。分別對其進(jìn)行結(jié)晶紫染色、鞭毛染色、原子力顯微鏡掃

3、描。得到細(xì)菌在各個階段的菌體形態(tài)，鞭毛、表面特征等指標(biāo)。然后在不同時間及位置小心刮取各生長階段的細(xì)菌，溶菌酶裂解細(xì)菌，提取蛋白質(zhì)，SDS-PAGE分離細(xì)菌全蛋白，并用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。之后篩選出差異條帶，酶解，提取肽混合物，進(jìn)行基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜檢測。最后根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，查閱大量文獻(xiàn)，篩選出與奇異變形桿菌波動生長機(jī)制相關(guān)蛋白，查閱編碼這些蛋白的基因，提取RNA，實時熒光定量PCR檢測其表達(dá)量，驗證其與波動生長存在相互作用。

4、>　　結(jié)果：培養(yǎng)基中加入TTC后，環(huán)上細(xì)菌變?yōu)榧t色;隨著培養(yǎng)基表面水份的增加，菌落環(huán)距減小;遷徙階段細(xì)菌菌體增長，鞭毛增多，鞏固階段菌體開始變短，鞭毛開始脫落;長菌表面粗糙，斷裂的短菌表面平整;與細(xì)菌運動有關(guān)的基因fusA、fliC1在遷徙階段表達(dá)量顯著性增高，而tufB表達(dá)量顯著性降低;與抗氧化應(yīng)激有關(guān)的基因hs10、ahpC在遷徙階段表達(dá)量顯著性增高;與代謝有關(guān)的基因icd表達(dá)量在遷徙階段顯著性增高，鞏固階段及變紅階段的環(huán)上細(xì)菌表達(dá)

5、量顯著性高于環(huán)間細(xì)菌，pyrC遷徙階段顯著性性增高，flaB變紅階段表達(dá)量顯著性增高。
　　結(jié)論：
　　1、加入TTC后環(huán)上細(xì)菌變紅，是由細(xì)菌在鞏固階段有氧呼吸恢復(fù)正常，三羧酸循環(huán)的限速酶琥珀酸脫氫酶含量增高，將TTC還原為甲臜而形成紅色。
　　2、奇異變形桿菌各生長階段細(xì)菌形態(tài)存在顯著性差異，且周期性變化。
　　3、奇異變形桿菌各生長階段的運動及代謝方式存在差異，遷徙階段細(xì)菌運動能力、抗氧化能力增強(qiáng)，呼吸功能、