奇異變形桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析、在雛雞體內(nèi)分布規(guī)律及亞單位疫苗研制.pdf

1、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，Pmirabilis)屬于腸桿菌科變形桿菌屬，廣泛分布于自然界中，常見于污水、土壤和堆肥中，是一種常見的腐生性條件致病菌(HoenigerJ.F.M.，1964)。在人類，本菌是引起食物中毒的主要元兇之一，近年來變形桿菌屬食物中毒在細菌性食物中毒中更是占有越來越大的比率，并呈逐年上升趨勢。而本菌在國內(nèi)引起肉仔雞發(fā)病，則在1996年才有報道，自此不斷有關于本菌感染雛雞的報道出現(xiàn)。奇異變形桿

2、菌主要引起禽類腹瀉、肢腿癱瘓、敗血癥、腦軟化等。各種日齡的雞群均可感染本病，但以4周齡以內(nèi)的雛雞最易感，本病既可水平傳播，又能垂直傳播，很容易造成爆發(fā)性流行疾病，對于種禽和肉雞養(yǎng)殖業(yè)具有潛在的巨大威脅（江益民，1996）。因此，為了探究奇異變形桿菌的致病機制及防治方法，本文從以下三個方面對其展開研究。
　　 1.16S-23S rRNA基因間隔序列PCR及RFLP對奇異變形桿菌分離株的鑒別與系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 根據(jù)臨床常

3、見致病菌16S-23S rRNA基因間隔序列(ISR)兩端的16S及23S rRNA保守序列設計PCR擴增的通用引物，對9株奇異變形桿菌和6株相近菌株應用通用引物PCR擴增16S-23S rRNA ISR序列。通過PCR長度多態(tài)性比較、RFLP分析以及部分序列測序比較，分析鑒別奇異變形桿菌。結果顯示，PCR長度多態(tài)性可以將奇異變形桿菌同其余菌種進行區(qū)分;RFLP分析可以將所有試驗菌種進行區(qū)分;部分序列測序可以對奇異變形桿菌進行分型。由此

4、表明，16S-23S rRNA ISR序列PCR及RFLP分析可以簡單、快速、準確的鑒定奇異變形桿菌。
　　 2.奇異變形桿菌在雛雞體內(nèi)的分布規(guī)律及動態(tài)變化
　　 應用本實驗室保存的奇異變形桿菌Q1株攻毒3日齡雛雞，建立奇異變形桿菌病動物模型。分別于攻毒后8h、16h、1d、2d、3d、7d，采集動物的心、肝、脾、肺、腎、法氏囊、肌胃、十二指腸、小腦等器官并迅速放入4％多聚甲醛中固定，然后建立免疫酶組織化學方法檢測固定的

5、組織器官;同時采集動物外周血涂板進行細菌培養(yǎng)。結果表明，奇異變形桿菌在組織器官中的定植時間順序為:十二指腸、小腦、法氏囊、脾＞肝、肺＞腎;在1 d-3d，細菌分布最廣，但在小腦和十二指腸分布最多;在7d，幸存動物中僅在十二指腸和小腦檢測到少量細菌;細菌主要定植于實質(zhì)細胞和上皮細胞中;所有血液涂板均檢測到攻毒菌。這說明，十二指腸和小腦是本菌主要的靶器官，實質(zhì)細胞和上皮細胞是本菌主要入侵的細胞，細菌可以進入循環(huán)系統(tǒng)，造成菌血癥或敗血癥。以上

6、結果說明了奇異變形桿菌在雛雞體內(nèi)的定植分布規(guī)律，初步解釋了本菌引起疾病的發(fā)病機制，為研究其預防治療方法奠定了基礎。
　　 3.泰山松花粉多糖增強雞奇異變形桿菌亞單位疫苗的免疫效果
　　 分別制備泰山松花粉多糖、白油、蜂膠三種佐劑，然后將其分別與奇異變形桿菌的外膜蛋白混合研制成亞單位疫苗（Ⅰ-Ⅴ分別為白油佐劑疫苗、蜂膠佐劑疫苗、泰山松花粉多糖佐劑疫苗、無佐劑疫苗和生理鹽水）。將300只1日齡雛雞隨機分為5組，每組60只，分

7、別于3、7、12日齡采用不同疫苗頸部皮下免疫雛雞。在首免后3、7、14、21、28、35、42和49 d，分別檢測外周血抗體滴度、白介素2(IL-2)含量和T淋巴細胞增殖率和小腸SIgA含量。在三免后7d，采用Q1株奇異變形桿菌攻毒，檢測每組疫苗對雛雞的保護力。結果表明，Ⅲ組疫苗的保護率最高;另外，本組的抗體滴度、IL-2和SIgA含量以及T淋巴細胞增殖率顯著升高，并且在多數(shù)檢測日期顯著高于其它組。這說明，泰山松花粉多糖可以顯著增強奇異