毛皮動物肺炎克雷伯氏菌分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析及其微膠囊疫苗的研制.pdf

1、肺炎克雷伯氏菌是一種條件致病菌，過去人們認(rèn)為對畜禽危害不大，一直未引起重視。但是近年來關(guān)于肺炎克雷伯氏菌引起毛皮動物疾病的報道卻在迅速增加，加之各種抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致該菌的耐藥性增強(qiáng)，多重耐藥菌株的出現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌病在毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)中危害越來越嚴(yán)重，因此隨著環(huán)境的改變，肺炎克雷伯氏菌作為人畜共患傳染病的病原，應(yīng)引起廣泛的重視。
　　 本研究對肺炎克雷伯氏菌在傳統(tǒng)的理化特性鑒定基礎(chǔ)上，又對12株不同動物來源的代表性菌株進(jìn)

2、行了23S rRNA基因序列的分析、構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，比較各菌種屬間的差異，為肺炎克雷伯氏菌在分子水平的系統(tǒng)學(xué)研究和遺傳多樣性研究奠定基礎(chǔ)，建立了一種快速、簡便的肺炎克雷伯氏菌的鑒定方法和23S rRNA基因序列分析方法。由于目前市場上尚沒有有效的肺炎克雷伯氏菌疫苗用于該病的防治，致使該病得不到合理有效的防治，嚴(yán)重制約著毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。因此本研究分別以泰山松花粉多糖、蜂膠等為佐劑，利用微膠囊技術(shù)制備了肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗，并口服

3、免疫小白鼠，檢測免疫指標(biāo)，對于肺炎克雷伯氏菌的防治具有重要意義，同時為新型口服疫苗和控釋制劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　 1.山東部分地區(qū)毛皮動物肺炎克雪伯氏菌分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析
　　 為確診近兩年造成毛皮動物（狐貍、貉子、水貂）死亡的主要細(xì)菌性病原，本研究在流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，對新鮮病死毛皮動物進(jìn)行臨床癥狀觀察、病理學(xué)檢查，同時取病變組織肝、肺、氣管為材料分離純化細(xì)菌，對所分離的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征、理化特性檢查及藥敏試驗

4、、致病性試驗和16S rRNA基因的分子鑒定。結(jié)果顯示，從剖檢病死毛皮動物的肺、肝、氣管組織等均檢出同種細(xì)菌，分離菌株對菌必治和舒巴坦高度敏感，對小白鼠具有較強(qiáng)致病作用，與已知的肺炎克雷伯氏菌的相應(yīng)序列的同源性為98.6％-100％。綜合分析，該分離菌株為克雷伯氏菌屬的肺炎克雷伯氏菌。
　　 2.不同動物種源肺炎克冒伯氏菌分離株23S rRNA序列分析
　　 通過PCR擴(kuò)增4株貂源、2株狐源、2株貉源、2株豬源和2株雞源

5、肺炎克雷伯氏菌的23S rRNA基因片段(727bp)，經(jīng)克隆測序，利用BLAST工具進(jìn)行同源性搜索;用DNAStar分析軟件進(jìn)行同源核苷酸序列的多重比較分析并構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌菌株的系統(tǒng)生物進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，本實驗室保存的12株肺炎克雷伯氏菌核苷酸序列與GenBank中收錄的X87284株肺炎克雷伯氏菌核苷酸序列同源性為96.8％-99.0％，而與沙門氏菌和奇異變形桿菌同源性只有90.0％-92.7％;8株毛皮動物肺炎克雷伯氏菌核苷酸

6、序列同源性為98.1％-99.9％，與豬源肺炎克雷伯氏菌核苷酸序列同源性為95.5％-98.1％，與雞源肺炎克雷伯氏菌的核苷酸序列同源性為96.7％-97.9％;豬源與雞源肺炎克雷伯氏菌的核苷酸序列同源性為95.9％-97.4％。結(jié)果表明，不同種源肺炎克雷伯氏菌23S rRNA基因序列同源性差異明顯，具有種屬的特異性，23S rRNA基因序列可以作為鑒定肺炎克雷伯氏菌的一種快速、簡便的方法。
　　 3.肺炎克雷伯氏菌微膠囊口服疫

7、苗的制備及其免疫效果檢測
　　 為探索肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗的免疫效果，本研究通過噴霧-界面配位改良法制備了肺炎克雷伯氏菌微膠囊疫苗，取清潔級昆明小鼠（雌性）200只，隨機(jī)分為5組:Ⅰ為松花粉多糖膠微膠囊疫苗組，Ⅱ為蜂膠微膠囊疫苗組，Ⅲ全菌體微膠囊疫苗組，Ⅳ為全菌體疫苗組和Ⅴ為空白對照組，將其口服免疫小白鼠后，ELISA方法檢測小腸中SIgA、血清中IgG抗體和IL-2水平，MTT法檢測外周血淋巴細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測外周