香魚鰻利斯頓氏菌的分離鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育研究.pdf

1、目的：
　　 分離鑒定香魚(Plecoglossus altivelis)出血漬爛病致病菌,通過分析致病菌耐藥性和人工感染香魚組織病理學(xué)變化,為香魚細菌性疾病的診斷和生產(chǎn)安全用藥提供理論基礎(chǔ)。
　　 采用生理生化鑒定的方法及采用多位點持家基因序列作為分子標(biāo)記,研究致病菌的系統(tǒng)分類學(xué)地位,旨在為香魚細菌性疾病的防治提供參考,并為微生物的分子生物學(xué)鑒定提供新思路。
　　 方法：
　　 1.分離純化人工養(yǎng)殖過程

2、中香魚潰爛病的致病菌。
　　 2.分析致病菌的耐藥性和致病菌感染香魚后引起的肝臟、腎臟和腸組織病理學(xué)變化。
　　 3.通過微生物生理生化特征鑒定致病菌的種類。
　　 4.利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計致病菌rpoB、ftsZ、topA等持家基因的特異性引物,擴增目的片段并進行序列測定。
　　 5.采用Clustal X、MEG.A4.0軟件對不同物種的持家基因的DNA序列或氨基酸序列進行比

3、對構(gòu)建進化樹,研究致病菌的系統(tǒng)分類學(xué)地位。
　　 結(jié)果：
　　 1.2008分離得到4株致病菌(編號:X01-X04)；2009年得到11株致病菌(編號:X0901-X0911),接種于凍存管中,于-20℃保存。
　　 2.測定了致病菌對常用漁藥的藥物敏感性,該致病菌對復(fù)方新諾明、利福平、恩諾沙星、新霉素和呋喃妥等藥物敏感。
　　 3.患病香魚的肝臟、腎臟和腸組織結(jié)構(gòu)與健康香魚的組織結(jié)構(gòu)相比發(fā)生明顯的變化

4、。肝臟細胞結(jié)構(gòu)不完整,部分溶解,形成大量細胞碎片,結(jié)構(gòu)松散,出現(xiàn)有大量的空泡；腎臟細胞完整性被破壞,腎小管結(jié)構(gòu)被破壞腎小管上皮細胞與周圍的組織分離,只留下腎小管的輪廓,腎間質(zhì)條索狀,腎小球部分壞死,中心呈淡紅色無結(jié)構(gòu)物質(zhì)；小腸上皮組織發(fā)生大面積潰爛,小腸絨毛及內(nèi)壁褶皺均已被破壞,小腸絨毛脫落,小腸上皮細胞壞死脫落裂解,腸腔內(nèi)可以看到大量的脫落壞死濃縮后的細胞碎片。
　　 4.通過對致病菌的生理牛化特征鑒定可知其氧化酶陽性、接觸酶

5、陽性、甘露醇陽性、吲哚陽性、硝酸鹽還原陽性、MR測定陽性、精氨酸脫羧酶陽性、精
　　 氨酸雙水解酶陽性；VP測定為陰性；利用葡萄糖、甘露糖和蔗糖產(chǎn)酸。
　　 5.擴增了atpA、gyrB、toxR、recA、ftsZ、rpoB、gapA、topA、hsp60、16SrDNA共10個位點的部分基因片段,并對其中的八個基因的DNA序列和topA氨基酸序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。
　　 結(jié)論：
　　 1.引起

6、養(yǎng)殖香魚出血潰爛病的致病菌為鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum),可以使用復(fù)方新諾明、利福平、恩諾沙星、新霉素和呋喃妥等漁藥對患病香魚進行治療。
　　 2.人工感染香魚短時間內(nèi)死亡,肝臟、腎臟和腸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化,推測器官功能衰竭可能是患病香魚迅速死亡的主要因為。
　　 3.本實驗擴增的toxR目的片段包括有toxR基因、toxS基因部分序列和其中間序列,且其GC含量明顯的低于其他基因,說明