水貂奇異變形桿菌分離鑒定及其OMPA基因克隆與原核表達(dá).pdf

1、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，P.mirabilis)屬于腸桿菌科、變形桿菌屬，是革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于自然界和人與動物體表，是一種較為常見的腐生性條件致病菌(Hoeniger,1964)，特別容易造成爆發(fā)性的流行，可導(dǎo)致人和畜禽的腹瀉，也可導(dǎo)致食物中毒、敗血癥和化膿性炎癥等。該菌既能水平傳播，又可垂直傳播。近年來，奇異變形桿菌在畜禽生產(chǎn)中引起的疫情數(shù)量呈上升趨勢，水貂、狐貍等多種水貂感染奇異變形桿菌的報道也頻繁

2、出現(xiàn)，以多種內(nèi)臟器官出現(xiàn)出血性敗血癥為主要癥狀特點，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。
　　目前，奇異變形桿菌的檢測一般采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定的方法，包括細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗、致病性試驗等。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，國外學(xué)者曾對奇異變形桿菌的PCR檢測方法做過相關(guān)研究。本研究采用傳統(tǒng)和PCR檢測方法分離鑒定菌株，為水貂奇異變形桿菌的快速檢測奠定了試驗基礎(chǔ)。
　　近些年來的試驗表明，外膜蛋白(OMP)作為細(xì)菌

3、細(xì)胞膜中的一種重要組成成分，具有良好的免疫原性，不僅能夠很好地刺激體液免疫，還能夠刺激細(xì)胞免疫作用。朱明華等提取奇異變形桿菌的OMP，將OMP免疫1日齡的雛雞，結(jié)果證明，奇異變形桿菌OMP具有良好的免疫原性與免疫保護作用（朱明華等，2010）。國外報道，奇異變形桿菌的外膜蛋白A作為一種保護性抗原，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分裂。本研究通過構(gòu)建奇異變形桿菌OMPA的原核表達(dá)質(zhì)粒，以獲得OMPA重組蛋白，并證明其具有反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研究水貂奇異變

4、形桿菌OMPA免疫保護作用及其功能、亞單位疫苗的開發(fā)奠定了試驗基礎(chǔ)。
　　本研究主要包括以下內(nèi)容:
　　1.水貂奇異變形桿菌的分離與鑒定
　　從山東某水貂養(yǎng)殖場的死亡水貂分離到一株致病菌，通過細(xì)菌形態(tài)特征及鏡檢、培養(yǎng)特性、生化鑒定、藥敏試驗和動物致病性試驗等傳統(tǒng)方法鑒定。生化鑒定結(jié)果表明，糖類多為陰性，氨基酸類為陰性，符合奇異變形桿菌的生化特性。藥敏試驗結(jié)果表明，本菌對恩諾沙星、頭孢類等具有高度敏感性，對青霉素與復(fù)合磺

5、胺等不具有敏感性。致病性試驗表明，該菌具有很強的致病性。在分子生物學(xué)檢測方面，根據(jù)奇異變形桿菌的OMPA基因設(shè)計了一對特異性引物，進(jìn)行PCR擴增，得到約1107bp大小的片段，與預(yù)期大小相符，從分子水平證明了其為奇異變形桿菌，為水貂奇異變形桿菌的鑒定及其疾病的診斷和治療提供了依據(jù)。
　　2.水貂奇異變形桿菌OMPA的克隆及原核表達(dá)
　　為了克隆與表達(dá)奇異變形桿菌外膜蛋白OMPA基因，并對其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性進(jìn)行研究，首先采用

6、PCR法擴增OMPA基因，將目的片段與pET28a(+)表達(dá)載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，然后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)該蛋白。SDS-PAGE分析表明，誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白的分子質(zhì)量大小約為45kDa，與預(yù)期的大小相一致，該蛋白以包涵體形式存在。Western-blot檢測結(jié)果顯示，該蛋白在45 kDa處與陽性血清反應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的分子量正確的條帶，表明該蛋白具有反應(yīng)原性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究水貂奇異變形桿菌外