降解膽固醇乳酸桿菌的分離、功能鑒定及其基因的克隆與表達(dá).pdf

1、血清膽固醇水平過(guò)高是引起心血管疾病的主要致病性因素。而血清膽固醇的降低與人類(lèi)的健康有緊密的聯(lián)系，因此，研究行之有效的降低血清膽固醇含量的方法已成為目前研究的焦點(diǎn)。大量研究表明，乳酸菌及其產(chǎn)生的膽鹽水解酶不但可顯著降低人和動(dòng)物體內(nèi)多余的膽固醇，而且還有各種保健功能。本研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.分離獲得了1株具有膽鹽水解酶基因且能高效降膽固醇的植物乳桿菌。
　　本研究成功建立了一種快速定向分離產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌的方法，并通過(guò)鄰苯二

2、甲醛法對(duì)初篩菌株進(jìn)行膽固醇降解率的測(cè)定，進(jìn)一步采用茚三酮法測(cè)定膽固醇降解率最高菌株的 BSH活性。結(jié)果表明，從中分離出14株產(chǎn) BSH且膽固醇降解率在17.5％～35.93%之間的乳酸菌，而菌株 DPP8的膽固醇降解率最高，可達(dá)35.93%，且菌株DPP8膽鹽水解酶的粗酶活為5.78 U/mL。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA分子生物學(xué)法鑒定菌株DPP8為植物乳桿菌，并命名為植物乳桿菌DPP8。
　　2. L. planta

3、rum DPP8的生物學(xué)特性及安全性評(píng)價(jià)。
　　首先對(duì) L. plantarum DPP8的酸和膽鹽耐受性進(jìn)行研究，結(jié)果表明， L. plantarum DPP8在 pH2.0、3.0、4.0的生理鹽水中處理3.0 h后，存活率分別為61.26%、78.92%、87.96%，在0.2%、0.3%、0.4%的牛膽鹽 MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6.0 h后，存活率分別為76.90%、71.31%、62.60%。L. plantarum D

4、PP8在1%～7%鹽濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)24 h后，該菌株的存活率達(dá)到13.15%以上。此外，研究了 L. plantarum DPP8在模擬人工胃腸道下的耐受性，結(jié)果表明， L. plantarum DPP8在pH3.0的人工胃液中作用3.0 h后，存活率達(dá)到14.12%，在人工腸液中處理10 h，存活率達(dá)到15.10%。通過(guò)測(cè)定L. plantarum DPP8生長(zhǎng)曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)，該菌株在4～10 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10～18 h后處于穩(wěn)定期。

5、并且對(duì) L. plantarum DPP8的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)試驗(yàn)期間小鼠均未出現(xiàn)死亡，表明L. plantarum DPP8是較安全的，對(duì)小鼠并未呈現(xiàn)毒害作用。
　　3.評(píng)價(jià)了L. plantarum DPP8對(duì)小鼠血脂的影響。
　　本研究將40只8周齡雄性健康 BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A）、高脂模型組（B）、高脂模型+生理鹽水組（C）、高脂模型+菌株L. plantarum DPP8組（D）。分別飼喂第

6、15 d、30 d，采血，測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。結(jié)果表明，灌胃第30 d，與 B組相比，D組 TC、TG、AI均極顯著降低（ P<0.01）， HDL-C顯著升高（ P<0.05）， HDL-C/TC水平極顯著升高（P<0.01）。因此，L. plantarum DPP8具有降解小鼠血清膽固醇的能力，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其為功能性微生態(tài)制劑提供了可能。
　　4．評(píng)價(jià)了不同劑量L. plantarum DPP8對(duì)羅曼

7、粉蛋雞生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)、蛋品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)成分、雞蛋黃和血清膽固醇含量的影響。
　　選取300只43周齡羅曼粉蛋雞，隨機(jī)分為5組，對(duì)照組（Ⅰ組）飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組分別飼喂不同濃度的 L. plantarum DPP8制劑。結(jié)果（1）Ⅱ組和Ⅲ組的產(chǎn)蛋率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；Ⅳ組的料蛋比顯著低于其余各組（P<0.05）。（2）Ⅲ組的血鈣水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），血糖水平極顯著低于對(duì)照組（P<0.01

8、），且顯著低于Ⅱ組（P<0.05）；與對(duì)照組相比，Ⅳ組血清的鈣、磷水平均顯著增加（ P<0.05），總白蛋白水平顯著降低（ P<0.05），血糖水平極顯著降低（ P<0.01）；Ⅴ組的血磷水平顯著增加（P<0.05），血鈣水平極顯著增加（P<0.01），血糖含量顯著降低（P<0.05）；Ⅲ組的血清總白蛋白水平顯著低于其余各組（P<0.05）。（3）與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組的蛋黃顏色、蛋白高度和哈氏單位均極顯著提高（P<0.01）；Ⅲ組和Ⅳ

9、組的蛋殼厚度顯著提高（P<0.05），Ⅴ組的蛋殼厚度極顯著提高（P<0.01）。（4）與對(duì)照組相比，Ⅳ～Ⅴ的 TC水平均顯著降低（P<0.05）；Ⅲ～Ⅴ組較對(duì)照組均極顯著降低了 TG水平（P<0.01），Ⅲ～Ⅴ組較Ⅱ組均顯著降低了 TG水平（P<0.05）；Ⅲ組較對(duì)照組、Ⅱ組均顯著提高了 HDL-C水平（P<0.05），Ⅳ組較對(duì)照組、Ⅱ組、Ⅴ組顯著提高了 HDL-C水平（P<0.05）；Ⅱ～Ⅴ組較對(duì)照組均顯著降低了 LDL-C（P<0.

10、05）。（5）與對(duì)照組相比，Ⅱ～Ⅳ添加組均顯著降低了蛋清相對(duì)重（P<0.05），且均顯著提高了蛋殼相對(duì)重（P<0.05）；Ⅲ～Ⅴ組較對(duì)照組均顯著提高了粗蛋白水平（P<0.05）。（6）與對(duì)照組相比，Ⅲ～Ⅴ組均顯著降低了蛋黃 TC水平（P<0.05）。由此可知，飼料中添加一定量的 L. plantarum DPP8具有改善蛋雞生產(chǎn)性能和提高蛋雞蛋品質(zhì)的作用，且2.0×108 cfu/kg組對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響效果優(yōu)于其他劑量組。
　

11、　5．成功克隆表達(dá)了L. plantarum DPP8的膽鹽水解酶。
　　通過(guò)PCR技術(shù)獲得了L. plantarum DPP8中的bsh基因，將擴(kuò)增后的bsh基因克隆到 pMD18-T載體上，并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。結(jié)果顯示：bsh基因長(zhǎng)975 bp，與GeneBank上公布的12株L. plantarum的bsh基因進(jìn)行比較，核苷酸同源性在99.3%～99.9%之間。將目的基因連接到大腸桿菌表達(dá)載體 p

12、ET32a(+)中，獲得了重組表達(dá)載體 pET32a(+)-bsh，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)中，通過(guò) IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)了重組蛋白， SDS-PAGE結(jié)果表明在約52 kDa處有一特異性條帶，與目的基因所推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量大小相符。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，在37℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)， pET32a(+)-bsh重組蛋白表達(dá)量最高。酶活性分析結(jié)果表明，表達(dá)膽鹽水解酶酶活為21.99 U/mL，是初