豆豉溶栓酶基因在乳酸桿菌中的表達(dá).pdf

1、乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是食品微生物的重要成員。由于它對(duì)人和動(dòng)物健康有益，因此它在食品及醫(yī)藥工程領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。乳酸菌中存在大量染色體外的遺傳物質(zhì)，為其克隆載體系統(tǒng)的發(fā)展提供了極好的材料。近10多年來，隨著乳酸菌內(nèi)源性質(zhì)粒的去除和電穿孔技術(shù)的建立以及乳酸菌中表達(dá)信號(hào)的分離，已建立和發(fā)展了一系列具有不同用途的乳酸菌載體和受體系統(tǒng)。這些載體包括克隆載體、整合載體及表達(dá)載體，而食品級(jí)基因表達(dá)載體的研究則

2、是近年來該領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。食品級(jí)表達(dá)載體利用食品級(jí)的選擇標(biāo)記替代了傳統(tǒng)的抗生素抗性選擇標(biāo)記，這就避免了將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動(dòng)物體內(nèi)。因此，乳酸菌食品級(jí)載體的研究與開發(fā)具有重要意義。 本研究以LacF基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，構(gòu)建了乳酸桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，并進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了豆豉溶栓酶基因在乳酸桿菌中的表達(dá)。首先以pRY300為出發(fā)載體，構(gòu)建了含有Latobacillus caseiATCC393乳糖操縱子LacF和LacG片段的整

3、合型表達(dá)載體pRVGF。利用T4DNA聚合酶消除pRVGF中LacF基因的Sph I位點(diǎn)，構(gòu)建了LacF基因編碼區(qū)移碼突變的質(zhì)粒pRVGAF，并將其電導(dǎo)入．L．casei ATCC393中。通過與L．casei ATCC393乳糖操縱子之間的同源雙交換，篩選到了LaeF<'->基因突變的受體菌株L．casei MBL25(LacF<'->)，并經(jīng)PCR和Lae表型所驗(yàn)證。利用乳酸桿菌乳糖操縱子基因啟動(dòng)子構(gòu)建了自主復(fù)制型載體pIAbeta

4、-plac。將豆豉溶栓酶不同肽段編碼序列分別插入到整合型載體和復(fù)制型表達(dá)載體中，共構(gòu)建了6個(gè)豆豉溶拴酶基因的表達(dá)質(zhì)粒。將重組表達(dá)質(zhì)粒pRVGF-BADFE(含豆豉溶栓酶成熟肽編碼序列電轉(zhuǎn)化L．casei MBL25后，篩選到所需的菌株MBL26。PCR分析結(jié)果顯示，豆豉溶栓酶基因已經(jīng)整合到L.casei MBL26染色體中，Lac<'+>表型也得到恢復(fù)。表明L.caseiMBL25中LacF基因的功能能被質(zhì)粒pRVGF-BADFE上的L