豆豉溶栓酶原料藥生產(chǎn)工藝及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、血栓性疾病現(xiàn)已成為人類(lèi)健康的第一大殺手，溶栓治療是最安全、有效的療法，但目前臨床使用的溶栓藥物都存在一定的副作用，且價(jià)格昂貴，研制高效、無(wú)副作用，廉價(jià)的新型溶栓藥物需求迫切。從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品——豆豉中發(fā)現(xiàn)的豆豉溶栓酶(DFE)不僅具有溶解血栓的功能，而且作用直接迅速、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、安全性好，可由微生物發(fā)酵生產(chǎn)造價(jià)低廉，有望彌補(bǔ)現(xiàn)有溶栓藥物的缺陷，具有開(kāi)發(fā)為新型溶栓藥物的巨大潛力。 本實(shí)驗(yàn)室已從豆豉中篩選到一株溶栓酶高產(chǎn)菌——HG

2、D107，本研究是在該菌株搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用15L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行DFE生產(chǎn)工藝放大試驗(yàn)，研究該酶的最適發(fā)酵工藝、最適提取工藝及主要酶學(xué)性質(zhì)，為工業(yè)化生產(chǎn)新型溶栓酶制劑提供依據(jù)。最終研究結(jié)果如下： 發(fā)酵的最適工藝條件：種子最適種齡為10h，二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，接種量為6％。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：豆粕粉4％，大米粉2％，K2HPO40.4％，KH2PO40.2％，MgSO40.07％，CaCl20.04

3、％，初始pH為7.5。發(fā)酵溫度為32℃，通風(fēng)量為10L/min，起始攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，發(fā)酵4h左右，溶氧濃度迅速降低時(shí)，提高到400r/min，至發(fā)酵結(jié)束。最適發(fā)酵時(shí)間為72h，發(fā)酵液酶活最高達(dá)2050.4u/mL。 提取的最適工藝條件：在室溫，料液pH自然的條件下，發(fā)酵液先離心固液分離，上清液再經(jīng)D392離子交換樹(shù)脂脫色，脫色液用硫酸銨進(jìn)行分級(jí)鹽析，鹽析沉淀經(jīng)超濾脫鹽，真空冷凍干燥制得DFE成品為灰白色干粉，比活力為

4、253.0u/mg，純化倍數(shù)為11.0，活性回收率為65.7％。 DFE的酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果：SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定DFE的分子量為31.0KD。DFE的最適作用溫度為42℃。在37℃保溫1h活力保持在90％以上；50℃保溫1h活力保持在80％左右；60℃保溫1h迅速失活，活力僅剩10％。DFE的最適作用pH為8.0。DFE最穩(wěn)定的pH范圍是6-9，4℃下放置24h，酶活保持在80％以上。模擬胃環(huán)境條件(pH2-3)下，胃蛋