短桿菌膽固醇氧化酶基因的表達(dá)研究.pdf

1、膽固醇氧化酶(EC1.1.3.6COD)在食品加工、醫(yī)療檢測(cè)、生物抗蟲(chóng)等方面的作用日益受到人們的重視，并且顯示出巨大的應(yīng)用潛力。本文主要研究短桿菌Brevibacteriumsp.DGCDC-82膽固醇氧化酶在大腸桿菌和在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)。 用PCR方法從Brevibacteriumsp.DGCDC-82染色體DNA中擴(kuò)增出含信號(hào)肽序列的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因，插入大腸桿菌表達(dá)載體pET28a(+)中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET

2、28a-COD(s+)。以pET28a-COD(s+)為底物，擴(kuò)增出不含信號(hào)肽的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a-COD(s-)。兩種重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)均獲得活性表達(dá)，不含信號(hào)肽基因的轉(zhuǎn)化子酶活較高。在轉(zhuǎn)化子中，兩種結(jié)構(gòu)基因與pET28a(+)攜帶的His-tag融合表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均表達(dá)出分子量約為55kD的蛋白質(zhì)，目的蛋白大都為沒(méi)有活性的包涵體，占細(xì)胞總蛋白的50％以上。 將不含信

3、號(hào)肽的膽固醇氧化酶基因克隆至含trp/lac雙啟動(dòng)子的表達(dá)載體pTrc99a中，并在大腸桿菌JM109中進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并分別考察了誘導(dǎo)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等因素對(duì)重組菌表達(dá)的膽固醇氧化酶的影響。在優(yōu)化條件下，該膽固醇氧化酶的酶活可以達(dá)到700U/L。酶學(xué)特性分析表明其反應(yīng)的最適pH為7.5，最適溫度為40℃。 將不含信號(hào)肽的膽固醇氧化酶結(jié)構(gòu)基因插入巴斯德畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K的EcoRI和NotI位點(diǎn)