草酸氧化酶基因轉化楊樹的研究.pdf

1、　　草酸作為真菌分泌的毒素并參與致病，目前已在核盤菌屬等10個屬中有報道。利用草酸降解酶的轉基因植物來獲得對分泌草酸病原真菌的抗性是一個極具前途的方法。而且，分解草酸所產生的H2O2對病菌侵襲的早期反應，信號轉導途徑中調節(jié)過敏性壞死反應以及激活植物防御基因表達等抗病反應過程中都發(fā)揮著重要作用?！　”狙芯坷酶┩寥罈U菌介導的葉盤法將來自小麥的草酸氧化酶基因(OxO)轉入優(yōu)良楊樹樹種，以獲得對多種病原真菌有“廣譜抗性”的轉基因楊樹。所用

2、工程菌為LBA4404，雙元植物表達載體為OxO-pGPTV-KAN，其上含有OxO基因gf2.8，卡那霉素(Kan)抗性標記基因。選用抗逆性較強、廣為種植的84K楊和三倍體毛白楊作受體材料。具體研究內容如下：　　1.建立了84K楊葉盤外植體高效再生系統(tǒng)。首次將2,4-D同時用于楊樹組織培養(yǎng)中的愈傷組織誘導和芽分化，篩選出最佳84K楊葉盤外植體最佳不定芽誘導培養(yǎng)基配方為：MS+0.02mg/L2,4-D+1.0～1.5mg/L6-BA

3、；葉盤誘導率高達90﹪～100﹪；每葉平均誘導芽數多達20個左右。　　2.通過腋芽分化獲得三倍體毛白楊無菌苗，并建立了三倍體無菌苗的擴繁體系。篩選出適宜三倍體毛白楊葉盤不定芽分化的培養(yǎng)基為1/2MS+0.75mg/L6-BA+0.01mg/LNAA+20g/L蔗糖；葉盤誘導率為60﹪左右；每葉平均誘導芽數為3～4個左右?！　?.進行了84K楊和三倍體毛白楊的卡那霉素敏感性測定。確定了84K楊和三倍體毛白楊葉片芽誘導卡那霉素臨界篩選濃

4、度分別為20mg/L和15mg/L；并確定了兩者芽生根卡那霉素臨界篩選濃度分別為20mg/L和15mg/L?！　?.摸索了根癌土壤桿菌介導的葉盤法轉化楊樹的各種影響因素?；敬_定適宜的轉化路線為：誘導培養(yǎng)基上葉盤預培養(yǎng)2～3d→OD600約為0.5稀釋的菌液中侵染5～10min→誘導培養(yǎng)基上共培養(yǎng)4～5d(暗培養(yǎng))→脫菌處理10d左右(誘導培養(yǎng)基附加適量濃度的頭孢霉素或羧芐青霉素)→選擇性生根培養(yǎng)基上篩選獲得抗卡那霉素再生苗(大約需要