家蠶磷酸吡哆醇氧化酶的基因表達分析.pdf

1、維生素B6(VB6)是一種水溶性維生素，游離型為吡哆醇(Pyridoxine，PN)、吡哆胺(Pyridoxamine，PM)和吡哆醛(Pyridoxal，PL)，相應磷酸酯形式為磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate，PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)。其中PLP是VB6的主要輔酶形式，除參加催化涉及

2、氨基酸代謝的各種反應外，還與細胞其他多種生理活動有關。植物和微生物可以從頭合成(de novo pathway)PLP，而動物則需要從外界攝取VB6 通過補救途徑(Salvage pathway)合成PLP。在PLP 補救合成途徑中，磷酸吡哆醇氧化酶(Pyridoxine-5’-phosphate oxidase，PNPO)發(fā)揮重要作用。在黃素單核苷酸(FMN)和O2 存在下，氧化底物PNP和PMP，生成PLP。
　　 家蠶(B

3、ombyx mori，B.mori)既是僅次于果蠅作為昆蟲研究的模式生物，也是支撐蠶絲業(yè)的生物基礎。家蠶在合成絲蛋白和生長發(fā)育時，體內(nèi)氨基酸的合成代謝非?；钴S，其中VB6 代謝是一個重要環(huán)節(jié)。PNPO在家蠶體內(nèi)VB6的轉換代謝中可能是一個關鍵控制點。
　　 我們實驗室前期采用生物信息學原理和PCR方法，構建家蠶PNPO 融合基因表達質(zhì)粒pET22b-His-PNPO，原核表達純化出重組蛋白，并且初步分析了家蠶PNPO的酶學性質(zhì)，

4、對其蛋白結構也進行了預測。
　　 本實驗將家蠶PNPO基因的重組表達質(zhì)粒pET-22b(+)-PNPO 轉化入Escherichia coli Rosetta中經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，獲得融合蛋白，經(jīng)純化后進行SDS-PAGE，以切膠的方式免疫家兔獲得抗血清。以家蠶5齡幼蟲的精巢、頭、腸、馬氏管、卵巢、表皮、脂肪體、絲腺8個組織為實驗材料制備粗蛋白提取液，進行Western blot，分析PNPO在家蠶不

5、同組織中的表達情況。
　　 同時，提取上述8個組織的總RNA。分別設計家蠶PNPO基因和內(nèi)參18S rRNA的特異性引物。采用熒光定量PCR，分析PNPO基因在不同組織中的轉錄情況。
　　 本實驗表達的PNPO以包涵體的形式表達且制備的多克隆抗體對重組蛋白具有良好的特異性。通過Western blot和熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)PNPO基因在家蠶5齡幼蟲各組織中的轉錄由高到低依次為精巢、頭、腸、馬氏管、卵巢、表皮、脂肪體、絲腺