硫氧化酶基因的克隆表達(dá)及輔酶原位再生體系的研究.pdf

1、黃素依賴型單加氧酶(ECl.14.13.8)，本文稱為硫氧化酶的研究在手性亞砜的合成中具有較大的應(yīng)用潛力。本研究在分析已報(bào)道的細(xì)菌基因組的基礎(chǔ)上，從鞘氨醇桿菌Ⅳaromaticivorans的基因組中找到8條可能表達(dá)硫氧化酶的基因ncml，ncm2，ncm3，nfml，nfm2，nfm3，nfm4和nfm5。這幾條基因序列的長(zhǎng)度分別為1650bp，1638bp，1953bp，1623bp，1704bp，1524bp，1518bp和172

2、2bp，編碼蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為61.6KD，61.38KD，72.47KD，60.16KD，63.02KD，57.31KD，57.48KD和62.13KD。利用pET-28a成功構(gòu)建了8條基因在大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件優(yōu)化后獲得可溶性蛋白NCM1、NCM2、NFMl、NFM2和NFM3。選擇NCMl、NCM2和NFM1進(jìn)行鎳柱純化。
　　 用茴香硫醚(PMS)檢測(cè)純化得到的3個(gè)蛋白的活性，僅有NCM1具有活性。

3、酶的理化性質(zhì)研究表明NCM1是NADPH依賴型，底物譜較廣，對(duì)芳香族硫醚及其衍生物和1，3-=噻烷的活性較高，對(duì)鏈?zhǔn)搅蛎岩约皫追N環(huán)酮的活性較低，最佳反應(yīng)溫度為55℃，最佳pH為8.87。
　　 本研究通過(guò)CHMO和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中共表達(dá)，系統(tǒng)研究了Ecoli全細(xì)胞對(duì)茴香硫醚的不對(duì)稱氧化。通過(guò)對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)中溫度、pH、底物濃度、細(xì)胞密度和添加物（NADP+、甘油、DMSO）等條件的優(yōu)化，用我們構(gòu)建的大腸桿菌全細(xì)胞催化體系氧