酚氧化酶原(proPO)編碼基因的原核表達(dá)及其體內(nèi)表達(dá)水平研究.pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase，簡稱PO，EC.1.14.18.1)在昆蟲的生理發(fā)育和內(nèi)源性免疫過程中具有重要功能，如黑化或包被入侵的病原物、昆蟲傷口的愈合等。目前對酚氧化酶酶原(proPO)的激活途徑進(jìn)行了很多研究，但對激活的整個過程和機制仍不太清楚;有研究表明鱗翅目昆蟲的proPO主要產(chǎn)生于血淋巴的類絳色細(xì)胞，但其進(jìn)化和形成過程尚不十分明確。為了進(jìn)一步研究昆蟲proPO的性質(zhì)與功能，探討其在昆蟲生長發(fā)育過程中的作用，本文采用鱗

2、翅目害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）和菜青蟲（Pieris rapae）為研究對象，采用RT-PCR技術(shù)克隆得到了編碼小菜蛾P(guān)xPPO1和PxPPO2基因的全長編碼區(qū)序列，并將該片段與表達(dá)載體pET-30a連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞后由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得融合蛋白。另外，本文采用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的成熟孢子侵染菜青蟲4齡幼蟲，并通過實時熒光定量PCR(Q

3、uantitative Real-time PCR)分析了侵染不同時間后PPO1在菜青蟲體內(nèi)的表達(dá)情況;收集不同發(fā)育時期菜青蟲血淋巴，統(tǒng)計其類絳色細(xì)胞的數(shù)量，研究不同發(fā)育時期類絳色細(xì)胞密度與PrPPO1表達(dá)量之間的關(guān)系。主要內(nèi)容如下:
　　1.將克隆到的PxPPO1的ORF片段插入到pET-30a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了長度為7451 bp的重組質(zhì)粒pET-30a-PxPPO1，在大腸桿菌系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，得到83 kDa(PxPPO

4、178.56 kDa，His-tag4.66 kDa)的目標(biāo)蛋白，該目標(biāo)蛋白的表達(dá)量占總細(xì)胞的50％以上，超聲破碎后分析，常規(guī)條件下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在。
　　2.將克隆得到的PxPPO2的ORF片段插入到pET-30a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了長度為7480 bp的重組質(zhì)粒pET-30a-PxPPO2，在大腸桿菌系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，得到84.5kDa(PxPPO279.86 kDa，His-tag4.66 kDa)的目標(biāo)蛋白

5、，該目標(biāo)蛋白的表達(dá)量占總細(xì)胞的50％以上，超聲破碎后分析，常規(guī)條件下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白以包涵體的形式存在。
　　3.優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件的結(jié)果表明，PxPPO1經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白的表達(dá)量均占細(xì)菌總蛋白表達(dá)量的60％以上，不同濃度對蛋白表達(dá)量的影響不明顯;PxPPO1在同樣條件下誘導(dǎo)不同時間，3h后，融合蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白表達(dá)量的32％，8h后，達(dá)到總蛋白的62％;不同溫度下誘導(dǎo)PxPPO1，30℃融合蛋白有較高的表

6、達(dá)，約占細(xì)菌總蛋白表達(dá)量的84％;在15℃誘導(dǎo)該比例達(dá)到73％。
　　4.PxPPO2經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白的表達(dá)量均占細(xì)菌總蛋白表達(dá)量的62％以上，不同濃度對蛋白表達(dá)量的影響不明顯;PxPPO2在同樣條件下誘導(dǎo)不同時間，3h后，融合蛋白的表達(dá)量僅占細(xì)菌總蛋白表達(dá)量的27％;6 h后，所占比例明顯上升，達(dá)到40％，誘導(dǎo)8h后，達(dá)到58％;不同溫度下誘導(dǎo)PxPPO2，在15℃、20℃、25℃和30℃培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)的蛋白

7、占菌體總蛋白的比例分別為60％、83.8％、86.6％和88.1％。
　　5.經(jīng)western印跡鑒定，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白為試驗所需要的目標(biāo)蛋白。這為下一步制備PxPPO1和PxPPO2多克隆抗體，對PxPPO基因進(jìn)行蛋白水平的分析和研究該酶的功能奠定了基礎(chǔ)，為酚氧化酶調(diào)控昆蟲生長發(fā)育及免疫反應(yīng)的研究提供了新思路。
　　6.球孢白僵菌（Beauveria bassiana）的成熟孢子侵染菜青蟲4齡幼蟲試驗表明，侵染6 h-1

8、2 h，PrPPO1的表達(dá)量顯著降低，在6h和12h的表達(dá)量分別為對照的0.59倍和0.18倍。然而在侵染后72 h PrPPO1的表達(dá)量大幅提高，約為對照表達(dá)量的9.00倍。在侵染后2h（1.12倍）、24 h(0.33倍)、48 h（1.06倍）PrPPO1的表達(dá)水平與對照相比沒有顯著性差異。
　　7.統(tǒng)計了不同發(fā)育時期菜青蟲血淋巴中類絳色細(xì)胞的數(shù)量，菜青蟲4齡幼蟲類絳色細(xì)胞密度為20.44×104個/mL，相對其他齡期密度最