日本沼蝦酚氧化酶原激活因子基因克隆及其表達分析.pdf

1、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense），俗稱青蝦，屬于甲殼綱(Crustarcea）、十足目（Decaplda）、長臂蝦科（Palaemonidae）、沼蝦屬（Palaemonidae），廣泛分布于我國多種淡水水域，是我國淡水蝦類養(yǎng)殖中一個重要的養(yǎng)殖品種。近年來，青蝦養(yǎng)殖中的病害問題日益凸顯，成為制約青蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素，亟待研究和解決。
　　酚氧化酶原激活系統(tǒng)（Prophenoloxidaseact

2、ivating system，pro-PO）是無脊椎動物先天免疫機制中最重要的組成部分。酚氧化酶原激活因子（prophenoloxidase-activating Factor，PPAF）是酚氧化物酶原激活及其輔因子絲氨酸同系物活化的重要因子，可以直接影響酚氧化酶的活力和機體的免疫防御機制。這些免疫相關(guān)因子在抵御病原微生物入侵，以及參與機體免疫活動，一直倍受關(guān)注。本研究通過RACE方法首次克隆了日本沼蝦PPAF的cDNA全長序列；通過半

3、定量PCR技術(shù)分別對目的基因進行了不同組織的表達譜分析,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　通過RACE技術(shù)首次得到PPAF基因的cDNA全序列，全長1261bp，包括364bp的5'UTR，822bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF），75bp的3'UTR。編碼區(qū)271個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量是30.389.86kDa，等電點為9.727，其中包含34個堿性氨基酸(K，R)，18個酸性氨基酸(D，E），94

4、個疏水性氨基酸(A，I，L，F(xiàn)，W，V），75個極性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）。開放閱讀框的組成分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其G、C堿基的含量（51.09％）高于A、T堿基的含量（48.91%）。分析日本沼蝦PPAF基因的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在84-277區(qū)域左右有一個胰蛋白酶功能域，在77-278區(qū)域中有一胰蛋白酶家族中的類絲氨酸蛋白功能域。
　　構(gòu)建了進化樹，分析表明日本沼蝦PPAF基因與中國對蝦的同源性最高，與家蠶、棉鈴蟲的同

5、源性最低。采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了PPAF基因在沼蝦體內(nèi)不同組織的差異表達情況。檢測結(jié)果顯示，PPAF基因在健康的日本沼蝦的不同組織內(nèi)表達水平差異顯著（P<0.05），在肝胰腺、鰓和血細胞等免疫相關(guān)的組織中的表達水平較高；而在肌肉、精巢、卵巢和甲殼等組織中的表達水平低。選取肝胰腺組織來檢測PPAF基因在沼蝦感染嗜水氣單胞菌后不同時期的表達量變化情況，以空白組的β-actin基因作標(biāo)準(zhǔn)，檢測不同時期表達量變化規(guī)律。
　　半定量P

6、CR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染了嗜水氣單孢菌后的72h內(nèi)，日本沼蝦的PPAF基因在肝胰腺、鰓、血細胞組織中的mRNA表達差異顯著（P<0.05）。PO活性在攻毒組中變化明顯，在嗜水氣單胞菌刺激后，PO活性在注射3小時后增加到4.23倍，與生理鹽水注射組相比有顯著的提高。嗜水氣單胞菌注射后的PO活性的顯著變化現(xiàn)象表明，細菌可以觸發(fā)酚氧化酶原激活系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成PO，說明青蝦的酚氧化酶原系統(tǒng)可以抵御外界細菌的侵襲，表明酚氧化酶原系統(tǒng)在青蝦的免疫系統(tǒng)中起