亞洲玉米螟幼蟲酚氧化酶原純化及其組織定位研究.pdf

1、采用硫酸銨沉淀、Blue Sepharose CL-6B親和層析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水層析的方法從亞洲玉米螟幼蟲血淋巴中純化得到酚氧化酶原(PPO)。PPO的純化倍數(shù)為369.85，回收率為35.34％。純化的PPO蛋白經(jīng)天然凝膠電泳及二維電泳分析測得其全酶相對分子量約為158 kDa，由兩個亞基組成，其中一個亞基分子量為80 kDa，pI為5.70，另一個亞基分子量為78 kDa，pI為6.50。純化的PP

2、O其氨基酸組成與大蠟螟酚氧化酶原相似。苯基硫脲、硫脲、二硫蘇糖醇和乙二胺四乙酸強烈抑制酚氧化酶(PO)活性，二乙基二硫代氨基甲酸酯和三乙基四胺六乙酸對PO活性抑制不顯著，鄰菲羅啉和乙二醇二乙醚二胺四乙酸不能抑制PO活性。與對照相比，Mg2+和Cu2+處理能夠增加PO活性。Mg2+和Cu2+處理使PPO中β-折疊含量顯著增加。采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)測得純化PPO中鎂和銅元素含量分別為5.674±2.294μg/mg和1.2

3、57±0.921μg/mg。結(jié)果表明：PPO是一種含銅鎂的金屬蛋白。 將純化的PPO蛋白分5次免疫，注射入Balb/C健康乳鼠皮下，ELISA檢測制備的多克隆抗體效價，Western雜交分析該抗體的免疫特異性，采用間接免疫熒光標記法對PPO進行細胞定位觀察，并采用膠體金標記的免疫電鏡對PPO進行組織定位觀察。結(jié)果表明：2只免疫鼠的pAb間接ELISA效價均高達10-5，其中第2號小鼠pAb效價最高為1：4.08×104。West