亞洲玉米螟GSTs RNAi干擾載體構(gòu)建及功能研究.pdf

1、亞洲玉米螟是我國(guó)重要的糧食害蟲(chóng)之一，分布廣且危害嚴(yán)重。亞洲玉米螟嚴(yán)重危害我國(guó)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)。目前對(duì)于亞洲玉米螟的化學(xué)防治和生物防治面領(lǐng)著亞洲玉米螟不斷產(chǎn)生抗藥性的制約。因此。探尋新的亞洲玉米螟生物防治途徑已成為急需解決的問(wèn)題。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們以亞洲玉米螟三齡幼蟲(chóng)對(duì)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)玉米抗性的取食相應(yīng)過(guò)稱為研究對(duì)象。構(gòu)建了此過(guò)程中的亞洲玉米螟中腸cDNA文庫(kù)。并結(jié)合測(cè)序結(jié)果與歐洲玉米螟EST序列構(gòu)建了玉米螟unigenes數(shù)據(jù)

2、庫(kù)。從unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)中選取了13個(gè)基因片段進(jìn)行克隆，結(jié)果表明:其中12個(gè)基因片段被成功克隆。同時(shí)我們對(duì)此過(guò)程中亞洲玉米螟幼蟲(chóng)中腸進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)自學(xué)研究。在中腸中發(fā)現(xiàn)了42個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白上調(diào)蛋白26個(gè)，下調(diào)蛋白16個(gè);在內(nèi)含物中共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白7個(gè)，下調(diào)蛋白12個(gè)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了19個(gè)蛋白，這19個(gè)蛋白在不同的處理?xiàng)l件下，在中腸和內(nèi)含物中的含量比例不同。對(duì)這些蛋白的功能分析表明:這些差異表

3、達(dá)蛋白具有不同的功能。這暗示了:亞洲玉米螟的取食相應(yīng)過(guò)程是一個(gè)多蛋白多網(wǎng)絡(luò)的響應(yīng)過(guò)程。與此同時(shí)我們結(jié)合了unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)部分編碼差異表達(dá)蛋白基因片段進(jìn)行克隆。為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是昆蟲(chóng)體內(nèi)一類重要的解毒酶系。在昆蟲(chóng)抗逆響應(yīng)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用家蠶GST蛋白序列在unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行本地blast比對(duì)。預(yù)測(cè)了8條亞洲玉米螟GST相關(guān)蛋白編碼基因片段。并成功克隆了其

4、中的6條。分別命名為:OfGSTd3，OfGSTd2，OfGSTe1，OfGSTo1，OfGSTo4,OfGSTe2，，OfGSTs1，OfGST-GP。通過(guò)結(jié)合不同的比對(duì)序列構(gòu)建亞洲玉米螟GSTs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明除OfGSTd2外其余的GSTs相關(guān)蛋白均可明確的進(jìn)行家族分類。之后，采用RT-PCR，我們探索了個(gè)GST基因在各齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)情況的變化。同時(shí)，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的先前研究，我們探索了我們已有的亞洲玉米螟GST相關(guān)基因在亞洲玉

5、米螟三齡幼蟲(chóng)取食響應(yīng)中表達(dá)情況的變化。之后，使用QRT-PCR和WesternBlot技術(shù)探索玉米內(nèi)生殺蟲(chóng)物質(zhì)丁布對(duì)本實(shí)驗(yàn)室先前發(fā)現(xiàn)的亞洲玉米螟OfGSTd1基因的誘導(dǎo)表達(dá)作用;并通過(guò)構(gòu)建RNAi干擾工程菌株。并使用丁布丁布飼喂試驗(yàn)驗(yàn)證RNAi工程菌的功能。相應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在丁布誘導(dǎo)可導(dǎo)致亞洲玉米螟OfGSTd1表達(dá)水平升高;干擾OfGSTd1后亞洲玉米螟對(duì)丁布的解毒能力減弱。這表明:亞洲玉米螟OfGSTD1蛋白可能參與亞洲玉米螟對(duì)丁