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文檔簡介
1、幾丁質(zhì)參與組成昆蟲的外骨骼及圍食膜等結(jié)構(gòu),其合成及降解過程的動(dòng)態(tài)調(diào)控對昆蟲的生長發(fā)育至關(guān)重要。幾丁質(zhì)酶(EC3.2.1.14)是昆蟲幾丁質(zhì)降解過程的關(guān)鍵酶之一,負(fù)責(zé)將幾丁質(zhì)多糖降解為幾丁二糖及幾丁三糖。昆蟲幾丁質(zhì)酶是由一個(gè)龐大的基因家族編碼的,該酶分為八個(gè)家族,其中Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶主要分布于中腸組織,對昆蟲圍食膜的合成及降解、含幾丁質(zhì)食物的消化以及對外來病原體的免疫等方面發(fā)揮重要功能,可能作為綠色殺蟲劑的潛在靶標(biāo)。因此,針對昆蟲Ⅳ家族幾丁
2、質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)及抑制劑的研究,有助于了解其結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系,并為綠色農(nóng)藥的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。
本研究主要內(nèi)容包括:⑴通過PCR擴(kuò)增及RACE等手段,得到了亞洲玉米螟來源的Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶OfChtⅣ的cDNA序列。該cDNA序列全長為1380 bp,編碼區(qū)長度為1218 bp,能夠編碼405個(gè)氨基酸,N-末端是長度為18個(gè)氨基酸的信號肽,推測其為分泌蛋白。系統(tǒng)分析顯示OfChtⅣ與歐洲玉米螟Ⅳ家族幾丁質(zhì)酶OnChtⅣ親緣關(guān)系最近。⑵構(gòu)
3、建了OfChtⅣ的表達(dá)載體,并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115細(xì)胞中。采用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)120 h時(shí),發(fā)酵液上清的相對活力達(dá)到最大。將硫酸銨沉淀、凝膠過濾和金屬螯合層析聯(lián)合使用,實(shí)現(xiàn)了重組ofChtⅣ的分離純化。⑶對重組OfⅣ進(jìn)行生化性質(zhì)表征。采用糖肽酶F處理OfChtⅣ,分析其具有N-糖基化現(xiàn)象。OfChtⅣ對pNP-β-(GlcNAc)2和膠體幾丁質(zhì)的最適pH均為酸性pH4.0;對膠體幾丁質(zhì)的Km值為13.11 mg·mL
4、-1,對pNP-β-(GlcNAc)2的Km值為0.21 mM。⑷萘酰亞胺類化合物和殼聚糖對OfChtⅣ均具有一定的抑制活性。隨著聚合程度的增大,殼聚糖對OfChtⅣ的抑制活性也有所增強(qiáng),其中殼五糖、殼六糖、殼七糖的IC50值分別為333.5μM、60.1μM和12.4μM。⑸20家族β-N-乙酰己糖胺酶是昆蟲幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)中的另一種關(guān)鍵酶。針對亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1,采用晶體結(jié)構(gòu)解析和分子對接等手段,對經(jīng)典抑制劑N
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