15249.亞洲玉米螟βn乙酰己糖胺酶fdl的克隆表達(dá)與生化性質(zhì)表征

1、碩士學(xué)位論文亞洲玉米螟pⅣ_乙酰己糖胺酶FDL的克隆表達(dá)與生化性質(zhì)表征RecombinantExpressionandBiochemicalCharacterizationofBⅣ_AcetylhexosaminidaseFDLfromtheInsectOstriniafurnacalis作者姓名：霍亞斂學(xué)科、專業(yè)：生物化堂皇盆王生物堂學(xué)號(hào)：21018110完成日期：大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大

2、連理工大學(xué)頌士學(xué)位論文摘要昆蟲細(xì)胞內(nèi)的IBNL酰己糖胺酶參與多種生理功能，包括幾丁質(zhì)和糖復(fù)合物的降解、Ⅳ聚糖的修飾和精卵相互作用等。昆蟲內(nèi)的8Ⅳ乙酰己糖胺酶FDL在高爾基體內(nèi)專一去除Ⅳ聚糖核心結(jié)構(gòu)d1，3甘露糖分支上的p1，2連接的N7酰葡糖糖胺(GIcNAc)，對(duì)昆蟲蛋白的翻譯后修飾具有重要的生理功能。但是它的酶學(xué)性質(zhì)目前知之甚少。1)本論文中，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)的方法獲得了亞洲玉米螟來源的p一Ⅳ乙酰己糖胺酶OfFDL的c

3、DNA序列，克隆獲得的cDNA序列全長為2241bp的堿基序列，其中CDS區(qū)的長度為1923bp，編碼640個(gè)氨基酸，其中N端3249氨基酸區(qū)域，預(yù)測(cè)為跨膜區(qū)域。實(shí)時(shí)定量PCR(RealtimePCR)分析顯示整個(gè)發(fā)育階段的OfFDL轉(zhuǎn)錄水平都相對(duì)較低且不具有明顯的規(guī)律。2)構(gòu)建了OfFDL截短體(氨基酸55640)的表達(dá)載體，并通過電擊法成功轉(zhuǎn)化到畢赤酵母細(xì)胞GSl15的感受態(tài)細(xì)胞中。120h的甲醇誘導(dǎo)后，培養(yǎng)基上清中酶的活性達(dá)到最大

4、。通過硫酸銨沉淀和金屬螯合層析兩步純化策略，獲得了具有高純度的重組蛋白OfFDL。3)測(cè)定了OffDL對(duì)四種底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括‰亂／‰值。OfFDL對(duì)Ⅳ乙酰葡萄糖胺底物(GIcNAc)的催化效率(由‰Ⅲ／‰值評(píng)估)是對(duì)Ⅳ乙酰半乳糖胺底物(GalNAc)的30～35倍，并且不具有底物抑制現(xiàn)象。重組蛋白OfFDL能夠選擇性水解GnGnPA底物上q一1，3分支上的D一1，2連接的GlcNAc，而不能水解a1，6一分支上GlcNAc，也不能降