鵝FSH-α基因mRNA表達規(guī)律及原核表達研究.pdf

1、甄霆鵝F S H ．Q 基因m R N A 表達規(guī)律及原核表達研究鵝F S H ．Q 基因m R N A 表達規(guī)律及原核表達研究摘 要鵝的繁殖力低下一直是困擾鵝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題，其核心在于鵝節(jié)律性排卵周期長，且具有間隙期。促卵泡激素( F S H ) 作為調(diào)節(jié)家禽卵泡發(fā)育重要的候選基因，越來越多研究表明，F(xiàn) S H 在家禽體內(nèi)主要促進次成熟卵泡合成孕酮，作用于小卵泡促進雌激素大量生成，從而促使卵泡發(fā)育成熟。本研究在探討促卵泡激素( F

2、 S H ) 基因及其負反饋調(diào)節(jié)基因卵泡抑制素( 小m ) 共同在鵝生殖周期內(nèi)表達變化規(guī)律基礎(chǔ)上，深入闡明F S H 在調(diào)控鵝產(chǎn)蛋過程中的作用。同時利用融合P C R 技術(shù)，將具有延長基因半衰期作用的C T P 序列添加到鵝F S H 基因各亞基的C 末端進行基因融合，通過構(gòu)建原核表達載體，獲得了p E T 3 2 a - F S H Q ．C T P 、p E T 3 2 a - F S H1 3 ．C T P 和p E T 3 2

3、a - F S H 1 3 - C T P ．Q 重組蛋白，以期為開發(fā)出鵝r F S H 生物制劑奠定基礎(chǔ)，也為提高鵝產(chǎn)蛋量提供依據(jù)。采用R T ．P C R 和R T ．q P C R 技術(shù)檢測F S H ．Ⅱ、I N H - Ⅱ在鵝的不同組織中以及不同生殖時期的m R N A 表達量。結(jié)果表明，鵝F S H ．Q 和I N H ．Q 基因m R N A 在心、肝、脾、下丘腦、腎、大腸、小腸、大腦、小腦、輸卵管、腺胃、垂體、肺、卵巢和

4、胸肌等組織中均有不同程度的表達，且在垂體、卵巢等生殖相關(guān)組織中表達較高。不同生殖時期的m R N A 表達量檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn) S H ．Q 基因表達量在產(chǎn)蛋期( 排卵前) 達到頂峰，顯著高于另外三個時期( 開產(chǎn)前期、產(chǎn)蛋期( 排卵后) 、抱窩期) ；I N H ．Q 基因表達量表現(xiàn)出與F S H - Q 相反的趨勢，在產(chǎn)蛋期( 排卵前) 達到最低值，研究揭示了鵝F S H ．Q 和I N H ．Ⅱ基因在鵝不同生殖時期的變化規(guī)律。根據(jù)N C

5、B I 上公布的鵝F S H 基因序列和原核表達載體p E T 3 2 a 的特點，設(shè)計了去除目的基因信號肽和含有酶切位點的特異性引物，經(jīng)融合P C R 擴增獲得了目的基因F S H Q．C T P 、F S H B ．C T P 和F S H 0 ．C T P ．Q ，通過構(gòu)建原核表達載體p E T 3 2 a - F S H 1 2 ．．C T P 、p E T 3 2 a - F S H 1 3 ．C T P 和p E T 3 2

6、 a - F S H 1 3 ．C T P ．a(chǎn) ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B L 2 1 ( D E 3 ) 中，經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)，S D S ．P A G E 檢測，蛋白純化。結(jié)果表明，三個融合蛋白F S H Ⅱ．C T P 、F S HB ．C T P 和F S H 1 3 ．C T P ．Q 的I P T G 最佳誘導(dǎo)時間分別為4 h 、5 h 和5 h ，最佳誘導(dǎo)濃度分別為0 ．2 m m o l ／L 、0 ．8 m

7、m o l ／L 和1 ．5 m m o l ／L ，且都是以包涵體形式存在，分子量分別為3 2 K D 、3 5 K D 和4 6 K D ，與預(yù)期大小一致。研究結(jié)果為開展鵝F S H 的基因免疫研究和鵝r F S H 生物制劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鵝；F S H 基因；融合P C R ；原核表達甄霆鵝F S H ．Q 基因m R N A 表達規(guī)律及原核表達研究F S H 1 3 - C T P - Q b y f u s i o n

8、 P C Ra n dc o n s t r u c t e d e x p r e s s i o n v e c t o r s p E T 3 2 a - F S H Q - C T P ．p E T 3 2 a - F S H1 3 一C T P a n d p E T 3 2 a - F S HB - C T P - Q a n d t r a n s f e r r e d t h e m i n t o E ．C O L

9、IB L 2 1 ( D E 3 ) ．P r o t e i n s w e r ep u r i f i e da f t e ri n d u c i n gb yI P T Ga n dc h e c k i n go fS D S —P A G E ．T h er e s u l t sc o n f i r m e d t h a tt h e b e s ti n d u c i n gt i m eo f I P T G

10、 o f t h r e ef u s i o n p r o t e i n sF S H a - C T P 、F S H1 3 - C T P 和F S H 1 3 - C T P - Q a l e4 h ，5 ha n d 5 h , r e s p e c t i v e l y ，a n d t h eb e s ti n d u c i n g c o n c e n t r a t i o n so f I P T G

11、 a r er e s p e c t i v e l y0 ．2 m m o l ／L ，0 ．8 m m o l ／La n d1 ．5 m m o l ／L ，a l lf u s i o n p r o t e i n sa r ee x i s t e di nt h ef o r mo f i n c l u s i o nb o d y ．A se x p e c t e d ，t h em o l e c u l a r

12、w e i g h to fF S H Ⅱ一C T P ，F(xiàn) S H 1 5 一C T Pa n dF S H 1 3 一C T P - Q i s 3 2 K D ，3 5 K D a n d4 6 K Dr e s p e c t i v e l y ．O u rd a t a l a yt h ef o u n d a t i o nf o ri m m u n i t y s t u d y o f g o o s e F S