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文檔簡介
1、乳酸桿菌作為人及動(dòng)物腸道正常菌群的優(yōu)勢菌,有諸多的益生功能,選擇它作為表達(dá)載體系統(tǒng)研制乳酸桿菌口服疫苗,可以實(shí)現(xiàn)乳酸菌的益生功能與外源基因特異性免疫的有效結(jié)合。已報(bào)道的乳酸桿菌的疫苗表達(dá)載體系統(tǒng),大多是以抗生素抗性作為外源基因穩(wěn)定表達(dá)的壓力,存在耐藥性基因擴(kuò)散的問題。因此,以非抗生素抗性為標(biāo)記和選擇壓力的系統(tǒng)的構(gòu)建,已成為新的研究熱點(diǎn)。 以非抗生素抗性為選擇壓力的染色體一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng),是以細(xì)菌的管家基因缺陷菌株為受體菌,在質(zhì)
2、粒上插入同源或異源完整受體菌缺陷的基因,作為外源基因表達(dá)載體穩(wěn)定的選擇性壓力。ThyA基因是細(xì)菌的一種管家基因,以其作為選擇壓力構(gòu)建的非抗生素抗性表達(dá)載體在國內(nèi)外的研究已較為成熟。 本實(shí)驗(yàn)從健康仔豬腸道黏膜上分離到3株乳酸桿菌,種屬鑒定后初步認(rèn)為其分別為嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)(命名為L1)、德氏乳桿菌德氏亞種(L.delbrueckii subsp.delbruecki)(命名為L5)和唾液乳桿菌(L.sali
3、varius)(命名為L13)。生長曲線測定結(jié)果表明,L1、L13的生長速度明顯高于L5。耐酸、耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果表明,酸對L1生長的影響并不大,pH值超過2.5,菌株的存活基本不受影響;pH值為1.5處理30min仍有一定的存活率。L13耐酸能力相對較差,只能耐受pH3.5和4.5。L1比L13更能耐受高濃度膽鹽,在0.1%膽鹽條件下,兩株菌4h后布的存活率分別為70.00%和46.67%:但當(dāng)膽鹽濃度為0.2%時(shí),4h后L1菌株的存活率
4、為1.67%,而L13菌株的存活率極低,僅為0.0167%;膽鹽濃度升至0.3%,4h后兩株菌的存活率不超過0.01%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,兩株乳酸菌對豬源大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。上述結(jié)果表明L1的性狀優(yōu)于L13,作為下一步試驗(yàn)的侯選菌株。 對L1菌株進(jìn)一步試驗(yàn),在添加一定濃度的胸腺嘧啶核苷和三甲氧芐二氨嘧啶的MRS選擇培養(yǎng)基上篩選得到TMP抗性、thyA基因突變型乳酸桿菌單菌落45個(gè)。將這45株
5、TMP抗性,thyA基因缺陷的嗜酸乳桿菌在豐富培養(yǎng)基中反復(fù)傳代,最終獲得一株生長良好、生物學(xué)性狀穩(wěn)定的thyA基因突變型嗜酸乳桿菌,命名為L1-30。將其在MRS培養(yǎng)基和MRS選擇培養(yǎng)基肉湯中傳代,每5代取200μL培養(yǎng)物涂MRS選擇培養(yǎng)基平板,計(jì)算每100個(gè)thyA基因突變菌落中,發(fā)生回復(fù)突變的比例。結(jié)果傳100代,先后207欠涂平板,在兩種培養(yǎng)基上均未發(fā)現(xiàn)有L1-30的回復(fù)突變株。認(rèn)為該菌在胸腺嘧啶或胸苷酸豐富和貧乏的環(huán)境下均能保持
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