衣蛾腸道內(nèi)角蛋白降解菌的分離鑒定和相關(guān)基因克隆與表達.pdf

1、從以羊毛為食的衣蛾幼蟲腸道中分離到能降解羊毛、羽毛角蛋白的金黃桿菌屬(Chryseobacterium sp.)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)、芽孢桿菌屬(Bucillussp.)和微球菌屬(Micrococcus sp.)四種微生物。對其中降解羊毛、羽毛角蛋白能力較強的窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas sp.)和芽孢桿菌屬(Bucillus sp.)菌株進行了形態(tài)學、分子生物學、系統(tǒng)進化的分析

2、并初步研究了它們的酶學性質(zhì)，并克隆和表達了它們的角蛋白酶基因。
　　根據(jù)Stenotrophomonas sp.和Bucillus sp.菌株的16S rDNA的測序結(jié)果，進行BLAST比對得到相似性較高的相關(guān)種屬，以此構(gòu)建了它們的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合形態(tài)學、16S rDNA的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹中的進化關(guān)系，分別將Stenotrophomonassp.和Bucillus sp.菌株命名為啫麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomon

3、as maltophiliaSHMP-2)和短小芽孢桿菌(Bucillus pumilus BP-3)。
　　對Bucillus pumilus BP-3的發(fā)酵產(chǎn)酶實驗進行初步研究，在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 rpm，隨著發(fā)酵時間的延長，該菌產(chǎn)胞外角蛋白酶的酶活性逐漸增大，在84 h達到產(chǎn)酶最高峰49.76U／mL；該酶的最適作用溫度是40℃，最適作用pH為8.0。
　　通過PCR技術(shù)從這兩株菌的基因組DNA中分別克隆到了

4、編碼角蛋白酶基因的最大開放閱讀框(ORF)。其中Stenotrophomonas maltophilia SHMP-2的角蛋白酶基因(kerH)序列全長為1904 bp，編碼634個氨基酸；Bucillus pumilus BP-3的基因序列(kerI)全長為1152 bp，由383個氨基酸組成；它們都含有信號肽序列。序列比對表明kerH與已報道的kerD基因序列相似性為96.27％，而與其它不同源的角蛋白酶基因的序列相似性只有30％左

5、右：kerI與已報道的來自短小芽孢桿菌的角蛋白酶基因序列相似性大于960%，與其它不同源的角蛋白酶序列相似性也較低。
　　利用原核表達系統(tǒng)(pGEX-4T-1和BL21(DE3))成功表達了kerI基因，獲得了分子量約為66 kD的蛋白(其中GST標簽的分子量是27 kD左右，kerI的蛋白分子量是39 kD左右)，同時對工程菌表達的角蛋白酶進行了酶學性質(zhì)的初步研究，超聲破碎后檢測上清酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導5 h后，酶活達到6.2