深海角蛋白降解菌Bacillus aquimaris JM7的發(fā)酵條件優(yōu)化及功能基因的克隆表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模持續(xù)擴大,羽毛作為家禽的副產物的大量堆積不僅造成環(huán)境破壞、病原微生物滋生,還會造成角蛋白資源的嚴重浪費。本研究采用條件溫和、工藝環(huán)保的微生物法降解羽毛角蛋白,利用液體發(fā)酵法探究菌株降解羽毛的最優(yōu)化條件,并對角蛋白酶基因進行克隆,進一步在大腸桿菌系統(tǒng)中進行融合表達,擬實現(xiàn)角蛋白酶的外源表達。
  1.以羽毛為唯一碳、氮源篩選到一株高效降解角蛋白的菌株海水芽孢桿菌Bacillus aquimaris JM7。對Bacil

2、lus aquimaris JM7以羽毛為底物的發(fā)酵條件進行了單因素及正交試驗優(yōu)化,實驗結果顯示:Bacillus aquimaris JM7降解羽毛最適發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基初始pH值為9.0;菌接種量4%(v/v);培養(yǎng)溫度40℃;搖床轉速150rpm;羽毛粉添加量為0.2%(m/v);額外添加氮源及蔗糖對菌株降解羽毛粉均有抑制作用。上述條件下培養(yǎng)30h后,羽毛粉降解率達74.5%,高于多數(shù)文獻報道水平。Bacillus aquimar

3、is JM7降解羽毛主要產生谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸等17種氨基酸。
  2.對角蛋白酶基因Ker02562進行了克隆、表達和純化。采用PCR技術擴增了角蛋白酶基因,其全長為963 bp,編碼了一個由320個氨基酸殘基組成、預計分子量為34.181kDa的蛋白質。構建了重組表達質粒并轉化大腸桿菌BL21(DE3)進行誘導表達,SDS-PAGE分析表明,重組角蛋白酶E. coli-pCold I-Ker02562的分子量為38kDa左

4、右(角蛋白酶34kDa,pCold I自身標簽4kD左右),和預測分子量一致。
  3.對純化后的角蛋白酶酶學性質研究結果表明:
 ?。?)酶的最適反應溫度為40℃,在10-50℃條件下熱穩(wěn)定性良好;最適pH為7.0-10.0,該條件下酶能保持90%以上的活性;
  (2)金屬離子Ca2+,F(xiàn)e2+,Sr2+對酶活具有促進作用;
  (3)濃度為5mM的PMSF和1mM、5mM的EDTA對酶活有抑制作用,說明該酶

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