發(fā)酵酸肉中降膽固醇乳酸菌的篩選、鑒定及其降膽固醇機(jī)制的初步研究.pdf

1、發(fā)酵酸肉是以新鮮豬肉為原料，加入米粉、鹽等調(diào)味品，在自然狀態(tài)下利用微生物進(jìn)行厭氧發(fā)酵而成，是一類有兩千多年歷史的發(fā)酵肉制品。目前主要流行于我國(guó)重慶、四川、貴州、廣西、湖南等地，是侗族、苗族、傣族和毛南族等少數(shù)民族生活中必需的肉食產(chǎn)品，有著豐富的飲食文化內(nèi)涵和廣泛的食用基礎(chǔ)。本論文以自制發(fā)酵酸肉為原材料，從中篩選具有降低膽固醇功效的乳酸菌，并通過(guò)生理生化和分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定、模擬體外消化環(huán)境測(cè)定菌株的生理特性，并對(duì)其降膽固醇機(jī)理

2、進(jìn)行初步研究。為發(fā)酵酸肉的功能作用和工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，為降膽固醇乳酸菌的研究和應(yīng)用提供原始菌株和基礎(chǔ)研究支持。
　　 1.降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定
　　 1.1降膽固醇乳酸菌的篩選結(jié)果
　　 以自制發(fā)酵酸肉為原材料，以劃線分離純化的方法在碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基分離得到乳酸菌。通過(guò)雞蛋黃為膽固醇源篩選出18株具有降膽固醇能力的乳酸菌菌株。其中，SR1和SR10兩菌株膽固醇降低率＞30％，占總比例的11.1

3、1％;僅有1株膽固醇降低率在10％以下，占總比例的5.57％。其余菌株膽固醇降低率在10％～30％之間。降膽固醇能力最強(qiáng)的SR10和最弱的SR18膽固醇降低率分別為32.78％、7.17％。說(shuō)明發(fā)酵酸肉中生長(zhǎng)的乳酸菌具有降膽固醇的能力，可降低發(fā)酵豬肉制品中膽固醇的含量，但不同菌株降膽固醇能力有差異。
　　 通過(guò)初篩，選擇降膽固醇能力較強(qiáng)的SR1、SR3、SR4、SR7、SR9、SR10、SR12、SR17八株乳酸菌株進(jìn)行兩次復(fù)篩

4、，測(cè)得膽固醇降低率都＞20％。其中以雞蛋黃為膽固醇源測(cè)得膽固醇降低率最強(qiáng)的四株菌株是SR10、SR12、SR1和SR7;以膽固醇膠束為膽固醇源測(cè)得降膽固醇能力最強(qiáng)的四株菌株是SR10、SR1、SR4和SR12。考慮到雞蛋黃中含有蛋白質(zhì)和卵磷脂等物質(zhì)，可能會(huì)影響菌體降膽固醇的效果。綜合初篩和復(fù)篩的篩選結(jié)果，選擇在以膽固醇膠束為膽固醇源中降膽固醇能力最強(qiáng)的SR10和降膽固醇能力較強(qiáng)的SR1為目的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以膽固醇膠束為膽固醇源測(cè)得菌

5、株SR10和SR1膽固醇降低率分別為35.73％、31.89％。
　　 1.2降膽固醇乳酸菌的鑒定及鑒定結(jié)果
　　 將篩選出的膽固醇降低率較高的兩株乳酸菌SR1和SR10進(jìn)行鑒定，兩株菌株其菌落生長(zhǎng)良好，呈圓形，邊緣整齊，正面中央凸起，表面濕潤(rùn)光滑，不透明，呈乳白色。油鏡下觀察，菌體呈現(xiàn)桿狀，革蘭氏染色后菌體呈現(xiàn)紫色(G+)。進(jìn)行過(guò)氧化酶、吲哚及糖醇等生理生化試驗(yàn)，鑒定結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合形態(tài)學(xué)觀

6、察結(jié)果初步判斷SR1和SR10菌株為乳桿菌。
　　 采用16SrRNA分子生物學(xué)方法，對(duì)菌株DNA進(jìn)行提取、擴(kuò)增、測(cè)序，獲得兩菌株SR1和SR10基因片段大小分別為1476bp和1480bp。測(cè)序結(jié)果在GenBank基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，與基因庫(kù)中消化乳桿菌16SrRNA基因序列的同源性為99％，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化結(jié)果鑒定SR1和SR10均為消化乳桿菌。
　　 2.發(fā)酵酸肉中已篩選的降膽固醇乳酸菌的生理特性研究
　　

7、 2.1已篩選降膽固醇乳酸菌生物學(xué)特性研究結(jié)果
　　 測(cè)得SR1和SR10生長(zhǎng)的最適pH為6.0～7.0，SR1的最低生長(zhǎng)pH為3.4，最高生長(zhǎng)pH為10.2。SR10的最低生長(zhǎng)pH為2.8，最高生長(zhǎng)pH為10.2。SR1和SR10最適生長(zhǎng)溫度都為30℃。與大部分乳酸菌的最適合生長(zhǎng)溫度和pH吻合。
　　 測(cè)定SR1和SR10的生長(zhǎng)曲線。SR1在4h左右從生長(zhǎng)期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，10h左右進(jìn)行穩(wěn)定期。SR10培養(yǎng)6h左右從生長(zhǎng)

8、期進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)12h左右進(jìn)行穩(wěn)定期。兩株乳酸菌的產(chǎn)酸速率隨著菌體密度的增加而提高，在培養(yǎng)過(guò)程中pH值不斷降低，特別是菌體從生長(zhǎng)期到對(duì)數(shù)期下降較為明顯，當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期后pH基本保持穩(wěn)定。SR1和SR10的生長(zhǎng)曲線中最低pH值都約為4.0。
　　 2.2已篩選降膽固醇乳酸菌模擬消化耐受性研究結(jié)果
　　 根據(jù)耐酸性實(shí)驗(yàn)，在pH為2.0、2.5、3.0的條件下對(duì)菌株培養(yǎng)6h后，SR1存活率分別為30.11％，38.55％，45

9、.61％;SR10的存活率分別為38.02％，48.53％，58.47％。表明SR1和SR10都有較強(qiáng)的耐酸性，且SR10較SR1對(duì)酸性環(huán)境的耐受性更強(qiáng)。說(shuō)明篩選菌株在酸性條件下具有較強(qiáng)的存活率。
　　 根據(jù)耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)，在0.1％，0.2％膽鹽條件下SR1和SR1培養(yǎng)8h后能夠正常生長(zhǎng)，在0.3％膽鹽條件下生長(zhǎng)受到抑制，經(jīng)過(guò)8h培養(yǎng)后測(cè)得SR1存活率為43.01％，SR10的存活率為39.73％。說(shuō)明篩選菌株具有較強(qiáng)的耐膽鹽性

10、。
　　 選用20種抗生素進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，在接種后的平板培養(yǎng)基上放入抗生素紙片，測(cè)得SR1的最大和最小的抑菌圈直徑分別為強(qiáng)力霉素37.85mm，卡那霉素7.85mm;SR10的最大和最小的抑菌圈直徑分別為美滿霉素38.03mm，慶大霉素7.44mm。說(shuō)明抗生素對(duì)篩選菌株有不同程度的抑制作用，但不同抗生素對(duì)不同菌株抑制其生產(chǎn)情況不一樣。
　　 3.篩選降膽固醇乳酸菌的降膽固醇機(jī)制初步研究結(jié)果
　　 3.1降膽固醇乳酸

11、菌降膽固醇能力與時(shí)間關(guān)系及其分析結(jié)果
　　 對(duì)消化乳桿菌SR10進(jìn)行同化作用和沉淀作用分析，測(cè)得12h和24h同化作用膽固醇降低率分別為14.98％和20.89％;沉淀作用膽固醇降低率分別為9.42％和12.80％。說(shuō)明在整個(gè)菌株生長(zhǎng)過(guò)程中同化作用和沉淀作用同時(shí)存在，且同化作用較沉淀作用降膽固醇的效果更加明顯。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了菌體在降膽固醇作用中，同化和沉淀作用同時(shí)存在，且在整個(gè)過(guò)程中同化作用起主要作用。
　　 3.2降膽固

12、醇乳酸菌酶來(lái)源及活性研究結(jié)果
　　 通過(guò)分別添加TritonX-100和硫酸銨兩種試劑對(duì)粗酶液進(jìn)行提取，并測(cè)定酶活力和蛋白質(zhì)含量。其中經(jīng)飽和度為70％的硫酸銨對(duì)粗酶液提取效果最好，分別測(cè)得胞外和胞內(nèi)酶活力為176.2U/mL，305.3U/mL;蛋白質(zhì)含量為2.45mg/mL，0.49mg/mL;比活力為70.5U/mg，611.8U/mg。酶活力胞內(nèi)粗酶液為胞外粗酶液的1.7倍，蛋白質(zhì)濃度胞外粗酶液為胞內(nèi)粗酶液的5倍，胞內(nèi)酶比