茯磚茶中降膽固醇類物質(zhì)的研究.pdf

1、茯磚茶是主要生產(chǎn)于湖南的中國(guó)古老茶類，可制成鮮奶、奶茶或熬煮成清茶進(jìn)行食用，研究表明其具有降血脂，降低人體膽固醇水平等保健功能。茯磚茶降血脂成分的研究主要為茶多酚，茶多糖，茶色素等，其限制了茯磚茶功能產(chǎn)品的開發(fā)及推廣應(yīng)用。冠突散囊菌為茯磚茶中的主要優(yōu)勢(shì)菌種，通過(guò)自身微生物代謝影響茯磚茶的品質(zhì)及風(fēng)味，它是判斷茯磚茶與其它茶葉不同的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。大量研究證明冠突散囊菌具有降血脂的作用，但目前的相關(guān)研究主要集中于冠突散囊菌調(diào)脂的宏觀效果及降脂

2、機(jī)理等方面，不能夠反映出冠突散囊菌降脂代謝的具體化學(xué)成分。同時(shí)，其它茶葉種類黑茶，普洱茶已被證明含有降血脂降血壓生物活性作用的洛伐他汀等物質(zhì)，紅曲霉，土曲霉，青霉等曲霉已被證明能夠產(chǎn)生他汀類物質(zhì)。而茯磚茶屬于黑茶的一種，冠突散囊菌屬于曲霉屬。
　　所以，本文通過(guò)TLC、UV、HPLC等不同檢測(cè)方法對(duì)茯磚茶及其優(yōu)勢(shì)菌種冠突散囊菌中的降膽固醇類成分他汀類物質(zhì)進(jìn)行定性及半定量分析，其研究結(jié)果如下所示:
　　1.以冠突散囊菌的菌落生

3、長(zhǎng)情況為指標(biāo)考察不同培養(yǎng)方式對(duì)冠突散囊菌生長(zhǎng)的影響，將其分別接種于5％NaCl的CZG培養(yǎng)基、麩皮固體培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行菌落生長(zhǎng)繁殖情況的觀察。結(jié)果顯示:不同培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)形態(tài)不同。冠突散囊菌在三種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在CZG和麩皮固體培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較弱，易產(chǎn)生孢子，而在液體培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)旺盛，但產(chǎn)生孢子較弱。冠突散囊菌在5％NaCl的CZG培養(yǎng)基、麩皮固體培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最佳時(shí)間分別為120h、168h、9

4、6h。
　　2.采用薄層色譜法分離茯磚茶，冠突散囊菌中他汀類組分，和洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品，辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比性研究。選用4組展開劑，3種顯色劑對(duì)樣品進(jìn)行展開效果研究。結(jié)果顯示:以氯仿∶甲醇∶水(25∶3∶1)為展開劑，碘蒸氣顯色，茯磚茶分離出7個(gè)斑點(diǎn)，冠突散囊菌分離出9個(gè)斑點(diǎn)，其中有2個(gè)明顯棕色斑點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照后確定為目標(biāo)斑點(diǎn)，Rf值分別為0.758，0.818。因此，確定茯磚茶，冠突散囊菌中含有他汀類的可能。
　　3.選用2

5、種標(biāo)準(zhǔn)品洛伐他汀、辛伐他汀作對(duì)照，采用紫外波長(zhǎng)掃描對(duì)實(shí)驗(yàn)收集的薄層組分中的降膽固醇類物質(zhì)他汀類進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明:標(biāo)準(zhǔn)品掃描結(jié)果顯示他汀類物質(zhì)有三個(gè)吸收峰，分別為228nm，238nm，246nm，其中238nm為最大吸收波長(zhǎng)，冠突散囊菌的薄層組分的甲醇溶解液有3個(gè)相對(duì)應(yīng)的吸收峰，其表明冠突散囊菌中含有目標(biāo)物質(zhì)。
　　4.以保留時(shí)間為參考指標(biāo)，采用高效液相分析了茯磚茶提取液、冠突散囊菌固體培養(yǎng)物提取液、薄層斑點(diǎn)組分提取液、柱層析無(wú)

6、色組分洗脫液、冠突散囊菌液體搖床發(fā)酵提取液中的降脂目標(biāo)組分，最終確定冠突散囊菌固、液培養(yǎng)物的乙酸乙酯提取液中含有洛伐他汀，保留時(shí)間分別為4.339min、15.209min，最高含量分別為0.550mg/kg、0.616mg/kg。
　　5.冠突散囊菌產(chǎn)降膽固醇類物質(zhì)洛伐他汀提取條件、高效液相色譜條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)、液態(tài)發(fā)酵條件及洛伐他汀穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的考察。(1)降膽固醇類物質(zhì)洛伐他汀提取條件的優(yōu)化:選用7中提取劑，經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)考查提取

7、劑種類，物料比，提取溫度，提取時(shí)間，提取次數(shù)對(duì)冠突散囊菌中洛伐他汀含量的影響，最終選用乙酸乙酯溶液作為提取劑，物料比1∶20，超聲波35℃下提取20min，提取次數(shù)3次，洛伐他汀含量達(dá)到最大。(2)高效液相色譜法的優(yōu)化條件為:建立測(cè)定洛伐他汀的高效液相色譜方法，最終確定使用C18色譜柱，以甲醇∶水(80∶20，v/v)為流動(dòng)相洗脫，流速1mL/min，柱溫室溫。進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證學(xué)實(shí)驗(yàn)，得出該方法的線性范圍分別為0.2-3.0μg/mL，0

8、.3-3.0μg/mL，回收率、精密度、重現(xiàn)性分別為99％、1.39％、1.32％。(3)液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn):經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)冠突散囊菌液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了培養(yǎng)時(shí)間，接種量，初始發(fā)酵pH值，濾液，菌絲體對(duì)洛伐他汀含量的影響。結(jié)果顯示:接種量10％，初始pH值為5.0，28℃培養(yǎng)96h，菌絲球數(shù)量較多，菌絲量較大，洛伐他汀主要生成于發(fā)酵初期，菌絲體中含量大于濾液。(4)降膽固醇類物質(zhì)洛伐他汀穩(wěn)定性的研究:以峰面積為指標(biāo)，考察不同