抗李氏桿菌細菌素及李氏桿菌噬菌體內(nèi)溶菌素CBD基因的克隆與表達.pdf

1、單核細胞增多癥李氏桿菌作為食源性致病菌，對食品安全造成嚴重的威脅?？刂评钍蠗U菌污染的有效方法之一就是在食品中添加細菌素。乳酸片球菌PA003產(chǎn)生的片球菌素是一種明顯抑制李氏桿菌的細菌素。為了解決野生菌株片球菌素產(chǎn)量低的問題，實現(xiàn)片球菌素的高效表達，本研究將片球菌素結(jié)構(gòu)基因pedA分別克隆到大腸桿菌及食品級乳酸乳球菌表達系統(tǒng)，進行異源表達；李氏桿菌噬菌體編碼的內(nèi)溶菌素是導致李氏桿菌裂解的因素之一，本研究將細菌素結(jié)構(gòu)基因與內(nèi)溶菌素中編碼細胞

2、表面結(jié)合蛋白（CBD）的基因構(gòu)建到同一乳酸乳球菌表達載體，觀察重組菌株吸附李氏桿菌并分泌細菌素的能力。
　　以乳酸片球菌PA003全基因組為模板將片球菌素的結(jié)構(gòu)基因pedA擴增后插入到表達質(zhì)粒pET32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，從克隆菌株中提取的重組質(zhì)粒含有pedA基因，其核苷酸序列與NCBI公布的片球菌素pedA基因序列（GenBank AY083244）同源性為100％。重組菌株經(jīng)誘導后，可高效表達

3、預期大小的22kDa硫氧還蛋白和片球菌素的融合蛋白，表達形式為包涵體。用谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的復性緩沖液處理后并采用Ni-IDA親和重力柱分離純化，在500mmol/L咪唑濃度下洗脫得到單一蛋白條帶。融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后得到與片球菌素大小一致的多肽，以李氏桿菌CVCC1595為指示菌，產(chǎn)量為512AU/ml培養(yǎng)液。采用相同的策略將擴增的pedA基因克隆到表達質(zhì)粒pET20b(+)中，利用載體的pelB信號肽實現(xiàn)融合蛋白在胞內(nèi)和細胞周質(zhì)

4、的可溶表達，片球菌素產(chǎn)量為384AU/ml培養(yǎng)液。
　　將乳酸乳球菌usp45信號肽序列和片球菌素結(jié)構(gòu)基因pedA連接，分別插入到大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭質(zhì)粒pMG36e的P32啟動子和乳酸乳球菌食品級表達載體pLEB688的P45啟動子后的多克隆位點，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ9000。重組菌液中檢測到分泌的片球菌素，對李氏桿菌有抑菌活性。
　　將含有P45啟動子、usp45信號肽和片球菌素結(jié)構(gòu)基因papA序列（P

5、45-SSusp45-papA），和含有P45啟動子、usp45信號肽和明串珠菌素C結(jié)構(gòu)基因lecC序列（P45-SSusp45-lecC）分別克隆到pBluescript/fliCΔH7質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JT1。重組大腸桿菌菌株能夠分別分泌具有抑制李氏桿菌活性的片球菌素和明串珠菌素C的表達產(chǎn)物。
　　將CBD基因分別克隆到分泌片球菌素、明串珠菌素C的乳酸乳球菌表達載體，轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌GRS5，實現(xiàn)細菌素基因與CBD基因的共表達

6、，獲得的重組菌株具有同時吸附李氏桿菌和分泌細菌素的能力。在此基礎上，通過菌體接合作用引入乳酸鏈球菌素產(chǎn)生和免疫基因，構(gòu)建能夠同時分泌片球菌素和乳酸鏈球菌素、以及明串珠菌素C和乳酸鏈球菌素的重組菌株，實現(xiàn)了兩類細菌素在相同表達載體中的共表達。
　　本研究構(gòu)建了硫氧還蛋白與片球菌素的融合蛋白在大腸桿菌細胞內(nèi)以包涵體形式存在的及可溶性分泌的兩種高效表達系統(tǒng)；實現(xiàn)了片球菌素在食品級表達系統(tǒng)乳酸乳球菌中的分泌表達；將CBD基因與細菌素基因在