兔波氏桿菌和巴氏桿菌LAMP快速診斷技術(shù)研究.pdf

1、兔波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）和巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是引起兔呼吸道傳染病的主要致病菌，臨床上這兩種菌有時(shí)呈現(xiàn)混合感染，由于它們?cè)诰湫螒B(tài)、臨床癥狀以及病理變化等方面都存在許多相似的地方，僅靠表面癥狀容易造成誤診，所以建立一種操作簡(jiǎn)便、快速靈敏和特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法顯得十分必要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplifica

2、tion，LAMP)技術(shù)是Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用，在恒溫條件下高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增靶基因，不需要PCR的熱循環(huán)步驟和繁瑣的電泳檢測(cè)過程，為病原在臨床上的快速診斷提供了全新的思路。
　　本研究針對(duì)Bb16S rRNA基因和Pm Kmt1基因，使用在線設(shè)計(jì)軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.

3、0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物，然后分別對(duì)反應(yīng)溫度和時(shí)間、dNTPs濃度、Mg2+濃度、Betaine濃度、Bst DNA Polymerase濃度以及引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了LAMP反應(yīng)體系。
　　本研究利用LAMP技術(shù)對(duì)8株兔源性細(xì)菌分別進(jìn)行Bb和Pm的特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有目標(biāo)菌株為陽(yáng)性，其余7株細(xì)菌均為陰性，表明LAMP檢測(cè)技術(shù)具有良好的特異性。
　　本研究采用Qiagen試劑盒法制備模板進(jìn)行LAMP

4、反應(yīng)，該方法檢測(cè)Bb和Pm的檢出限分別為1.65CFU/mL和1.29CFU/mL，而對(duì)照PCR檢測(cè)Bb和Pm的檢出限分別為165CFU/mL和129CFU/mL，表明LAMP技術(shù)的靈敏度為普通PCR的100倍。
　　本研究用已優(yōu)化的LAMP檢測(cè)方法分別對(duì)15份Bb陽(yáng)性樣品和10份Pm陽(yáng)性樣品進(jìn)行穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性與重復(fù)性。
　　本研究比較了3種基因組DNA提取方法對(duì)LAMP檢測(cè)

5、結(jié)果的影響，研究結(jié)果表明LAMP方法對(duì)制備模板DNA的要求不高，采用煮沸法提取基因組DNA，不僅節(jié)約提取時(shí)間，而且也大大降低檢測(cè)成本。
　　本研究分別檢測(cè)了54份Bb樣品和44份Pm樣品，同時(shí)與實(shí)驗(yàn)室已建立的PCR方法做了比較，結(jié)果表明:Bb-LAMP方法的陽(yáng)性檢出率為77.78％，特異性為85.71％，敏感性為100％，符合率為96.3％;Pm-LAMP方法的陽(yáng)性檢出率為47.73％，特異性為88.46％，敏感性為100％，符合