豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病病原特性與PCR檢測技術(shù)研究.pdf

1、兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起兔的一種傳染病，該病傳播快、病程急、發(fā)病率與死亡率高，常給養(yǎng)兔業(yè)造成巨大損失。該病病原血清型復(fù)雜，不同血清型之間交互免疫效果不理想，且在不同地區(qū)流行的血清型差異較大，給防治工作帶來較大難度。為了摸清豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病的具體發(fā)生情況，并對(duì)該病做到早期快速診斷與有效預(yù)防，本研究主要從以下4方面進(jìn)行了研究： 1.兔多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定 本研究對(duì)2003～2005年間來自豫西地區(qū)的疑似巴

2、氏桿菌病兔進(jìn)行剖檢與病原分離，先后共鑒定多殺性巴氏桿菌18株，分別編號(hào)為P1、P2……P18，其中P1、P2……P11來源于肉免，P12. P13……P18來源于獺兔。血清瓊脂平板上，18株分離菌的菌落所帶的熒光有三類，F(xiàn)o型熒光10株，F(xiàn)g型熒光5株，中間型3株。藥敏試驗(yàn)表明，18株分離菌一半以上對(duì)氟哌酸、慶大霉素、痢特靈3種常用抗菌藥耐藥；對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙殺星的耐藥菌株較少；多數(shù)菌株對(duì)先鋒霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐

3、青霉素中度敏感或高度敏感。毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，18株分離菌中有10株(P1、P2、P5、P6、P8、P10、P11、P13、P15、P16)對(duì)仔兔的致死菌量在20 cfu/只以下，毒力比較強(qiáng)，占分離株的55.6％。其中5株(P1、P2、P8、P13、P16)分離菌的致死菌量在10 cfu/只以下，為強(qiáng)毒。不同熒光型的菌株毒力不同，F(xiàn)o型菌、Fg型菌對(duì)小白鼠與仔兔的毒力比較強(qiáng)，中間型菌毒力較弱。 2.兔多殺性巴氏桿菌分離株免疫學(xué)特性

4、研究 本研究在病原分離鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)18株巴氏桿菌分離株進(jìn)行了血清學(xué)分型鑒定。采用間接血凝試驗(yàn)對(duì)分離株的莢膜抗原進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明18株分離菌的莢膜抗原均為A群；采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)18株分離菌的菌體耐熱抗原進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離株的菌體耐熱抗原主要有兩型：1型14株(77.8％)、3型4株(22.2％)。將P1、P2、P5、P6、P8、P10、P11、P13、P15、P16毒力較強(qiáng)的10株巴氏桿菌分離株接種改良馬丁肉湯進(jìn)行培養(yǎng)

5、，菌液用甲醛滅活制成滅活疫苗；將疫苗接種小白鼠進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，疫苗接種后21天，分別用同源菌株、標(biāo)準(zhǔn)株C51-2、標(biāo)準(zhǔn)株C51-3攻擊，其保護(hù)數(shù)在3/5以上的分別有9株、7株、4株。用這10株滅活疫苗對(duì)哈白兔接種進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，疫苗接種后14天，用同源菌株攻擊，保護(hù)數(shù)在3/5以上有7株；用標(biāo)準(zhǔn)株C51-2攻擊，保護(hù)數(shù)在3/5以上的4株；用標(biāo)準(zhǔn)株C51-3攻擊，保護(hù)數(shù)在3/5以上的3株。選用免疫保護(hù)效果較好的兩個(gè)血清型巴氏桿菌分離株P(guān)

6、1(A:1)、P2(A:3)滅活疫苗接種家兔，用兔巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C51-2(A:1)、C51-3(A:3)分別攻毒進(jìn)行交互免疫試驗(yàn)，結(jié)果表明1型菌P1株滅活疫苗對(duì)3型菌有一定的交互免疫作用，3型菌P2株滅活疫苗對(duì)1型菌的交互免疫作用較弱。 3.兔多殺性巴氏桿菌二價(jià)蜂膠滅活疫苗的研制 為有效控制豫西地區(qū)兔巴氏桿菌病的發(fā)生，保障養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展，本研究選用免疫保護(hù)效果較好的多殺性巴氏桿菌地方分離強(qiáng)毒株P(guān)1(A:1)、P2(A

7、:3)為疫苗株，以改良馬丁肉湯進(jìn)行液體培養(yǎng)制備抗原，將滅活的抗原輔以具有廣譜生物學(xué)活性的天然物質(zhì)-蜂膠為免疫增強(qiáng)劑，制備了兔巴氏桿菌二價(jià)蜂膠滅活疫苗。動(dòng)物免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，二價(jià)蜂膠滅活疫苗安全可靠，免疫后14d可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)保護(hù)力，對(duì)兔巴氏桿菌病的近期保護(hù)率明顯優(yōu)于二價(jià)水苗，可高達(dá)100％。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠代替本動(dòng)物進(jìn)行二價(jià)疫苗效力檢驗(yàn)取得成功，本效力檢驗(yàn)方法可降低檢驗(yàn)成本，具有更敏感、更特異、更客觀、更簡便等特點(diǎn)。用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定動(dòng)物接

8、種疫苗后的抗體消長規(guī)律，用攻毒法測定疫苗的免疫期與保存期。結(jié)果表明，該疫苗的免疫期為6個(gè)月以上；4℃～8℃的保存期為12個(gè)月，15℃～30℃的保存期為6個(gè)月。 4.兔多殺性巴氏桿菌PCR檢測方法的建立及應(yīng)用 傳統(tǒng)的兔巴氏桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷常采用涂片染色鏡檢、病原分離、生化鑒定等方法，但這些方法較繁雜費(fèi)時(shí)，且檢出率較低。為建立本病快速特異的檢測方法，本研究根據(jù)Genbank中13株多殺性巴氏桿菌的外膜蛋白(OmpH)基因序列

9、，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了兔多殺性巴氏桿菌的PCR檢測方法，并對(duì)DNA的提取方法進(jìn)行了比較，對(duì)PCR體系各反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)建立的兔多殺性巴氏桿菌的PCR擴(kuò)增片段大小為526bp。兔和禽類的標(biāo)準(zhǔn)株C51-2和C48-1均能擴(kuò)增出526bp的特異性目的條帶，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的18株兔巴氏桿菌也均能擴(kuò)增出526bp的目的條帶。而對(duì)兔大腸桿菌、鏈球菌、支氣管敗血性波氏桿菌和葡萄球菌球菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性檢測結(jié)果表

10、明，當(dāng)反應(yīng)體系中模板DNA的量為1pg時(shí)，仍能看到較清晰的條帶，說明建立的PCR方法敏感性較好，只要檢測樣品中有病原核酸存在，PCR反應(yīng)即可順利完成，而得到準(zhǔn)確診斷結(jié)果。用該P(yáng)CR法檢測了先后從洛陽、三門峽等周邊地區(qū)送檢的40份疑似巴氏桿菌病兔病料，檢出多殺性巴氏桿菌陽性29例，陽性率為72.5％。同時(shí)與傳統(tǒng)的細(xì)菌檢查法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，該P(yáng)CR檢測法的檢出率是傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查法的2.08倍，說明該P(yáng)CR方法在臨床診斷中具有極強(qiáng)