肺炎克雷伯氏桿菌dha調(diào)節(jié)子中關(guān)鍵酶基因克隆及共表達.pdf

1、1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，作為增塑劑、洗滌劑、防腐劑、乳化劑、耐高壓潤滑劑、染料、油墨、防凍劑、抗凍劑、融雪劑等被廣泛的應(yīng)用于食品、化妝品、紡織、印染、醫(yī)藥、涂料等行業(yè)。同時，1，3-丙二醇也是合成聚酯纖維(PTT)的主要單體。據(jù)資料統(tǒng)計，2001年全世界1，3-丙二醇年生產(chǎn)能力僅為13.6萬噸，遠遠不能滿足市場需求，且價格昂貴。目前，我國1，3-丙二醇產(chǎn)量非常少，大宗工業(yè)用1，3-丙二醇仍需進口。因此，開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)

2、權(quán)的1，3-丙二醇生產(chǎn)技術(shù)對推動我國PTT材料和其它相關(guān)行業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。 目前1，3-丙二醇的生產(chǎn)主要采用化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。但由于微生物發(fā)酵法自身無法克服的弊端，如發(fā)酵周期長、發(fā)酵產(chǎn)物不易分離、且只能以附加值較高的甘油為底物，因此在經(jīng)濟上還無法與化學(xué)合成法競爭。而以廉價底物(如玉米淀粉水解液)為碳源，用基因工程菌一步法生產(chǎn)1，3-丙二醇，在生產(chǎn)成本上只是化學(xué)合成法的五分之一。因此，本論文旨在通過對肺炎克雷伯

3、氏桿菌dha調(diào)節(jié)子中關(guān)鍵酶基因的克隆、序列分析和串聯(lián)表達的研究，實現(xiàn)甘油轉(zhuǎn)化1，3-丙二醇基因工程菌的構(gòu)建。以期為構(gòu)建以葡萄糖為底物，一步發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的基因工程菌奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 本文以肺炎克雷伯氏桿菌基因組DNA為模板，通過PCR技術(shù)擴增了dha調(diào)節(jié)子中的gldABC、dhaT、dhaKL、dhaD四個酶基因。在此基礎(chǔ)上，成功地構(gòu)建了pMD19-TSimple/gldABC、pMD19-TSimple/dhaT

4、、pMD19-TSimple/dhaKL、pMD19-TSimple/dhaD克隆載體；pET-28a(+)/gldABC-dhaT、pET-28a(+)/dhaKL-dhaD、pCDFDuet-1/gldABC-dhaT-dhaKL-dhaD串聯(lián)表達載體；以及pET-28a(+)/gldABC-dhaT和pCDFDuet-1/dhaKL-dhaD、pET-28a(+)/dhaKL-dhaD和pCDFDuet-1/gldABC-dhaT

5、共表達載體。通過對gldABC、dhaT、dhaKL和dhaD基因測序、序列分析及表達研究得出了以下結(jié)論： 甘油脫水酶基因(gldABC)全長2700bp，包括三個開放閱讀框架(ORF1、ORF2、ORF3)。ORF1全長為1668個堿基，是以ATG起始密碼子開始，UAA終止密碼子結(jié)束，編碼由555個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為60.660KDa；ORF2全長585個堿基，是以GTG起始密碼子開始，TAA終止密

6、碼子結(jié)束，編碼由194個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為21.355KDa；ORF3全長為426個堿基，是以ATG起始密碼子開始，TAA終止密碼子結(jié)束，編碼由141個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為16.104KDa。通過BLAST同源性分析，該基因與GenBank中已發(fā)表的gldABC基因(U60992)的核苷酸序列同源性為99.39％。氨基酸序列的同源性為100％ 1，3-丙二醇氧化還原酶(dha

7、T)基因的全長為1164個堿基組成，是以ATG起始密碼子開始，UGA終止密碼子結(jié)束，編碼由387個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為41.520KDa。通過BLAST同源性分析，與GenBank上已發(fā)表的KPU30903的核苷酸序列的同源性達99.48％，氨基酸序列的同源性為100％。 甘油脫氫酶(dhaD)基因的全長為1104個堿基組成，是以ATG起始密碼子開始，UAA終止密碼子結(jié)束，編碼由367個氨基酸殘基組成的

8、多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為40.370KDa。通過BLAST同源性分析，與GenBank上已發(fā)表的AL627279.1的核苷酸序列的同源性達83％，氨基酸序列的同源性為91％。 二羥丙酮激酶基因由兩個開放閱讀框架組成。dhaK開放閱讀框架(ORF1)全長為1017個堿基組成，是以ATG起始密碼子開始，TAA終止密碼子結(jié)束，編碼由356個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為39.160KDa。dhaL開放閱讀框架(O

9、RF2)全長為633個堿基組成，是以ATG起始密碼子開始，TAA終止密碼子結(jié)束，編碼由210個氨基酸殘基組成的多肽鏈，該多肽鏈的計算分子量為22.632KDa。通過BLAST同源性分析，與GenBank上已發(fā)表的U00096.2的核苷酸序列的同源性達99％，氨基酸序列的同源性為99.7％。 37℃、1mmol/LIPTG(終濃度)誘導(dǎo)重組大腸桿菌E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT2h。SDS-PAGE電泳

10、結(jié)果表明分別在約61KDa、42KDa、21KDa、16KDa的位置上出現(xiàn)了特異性條帶。上清液中酶活性分別為甘油脫水酶23.7U/ml，1，3-丙二醇氧化還原酶30.4U/ml。 37℃、1mmol/LIPTG(終濃度)誘導(dǎo)重組大腸桿菌E.coli/pET-28a(+)/dhaKL-dhaD2h。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明分別在40KDa、39KDa、23KDa的位置上出現(xiàn)了特異性條帶。上清液中酶活性分別為甘油脫氫酶26.3U

11、/ml，二羥丙酮激酶31.0U/ml。 37℃、1mmol/LIPTG(終濃度)誘導(dǎo)E.coli/pCDFDuet-1/gldABC-dhaT-dhaKL-dhaD重組大腸桿菌3h。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明分別在約為61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出現(xiàn)了特異性條帶。上清液中酶活性分別為甘油脫水酶14.4U/ml、1，3-丙二醇氧化還原酶20.1U/ml、甘油脫氫酶19

12、.5U/ml、二羥丙酮激酶22.8U/ml。 37℃、1mmol/LIPTG誘導(dǎo)E.coli/pET-28a(+)/gldABC-dhaT/pCDFDuet-1/dhaKL-dhaD重組大腸桿菌3h。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明分別在約為61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出現(xiàn)了特異性條帶。上清液中酶活性分別為甘油脫水酶17.5U/ml、1，3-丙二醇氧化還原酶24.5U/m

13、l、甘油脫氫酶21.2U/ml、二羥丙酮激酶22.3U/ml。 37℃、1mmol/IPTG誘導(dǎo)E.coli/pET-28a(+)/dhaKL-dhaD/pCDFDuet-1/gldABC-dhaT重組大腸桿菌3h。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明分別在約為61KDa、42KDa、40KDa、39KDa、23KDa、21KDa、16KDa的位置上出現(xiàn)了特異性條帶。上清液中酶活性分別為甘油脫水酶16.4U/ml、1，3-丙二醇氧化還原