金錢魚HUFA合成關(guān)鍵酶基因的克隆、功能鑒定及營養(yǎng)調(diào)節(jié).pdf

1、高度不飽和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids, HUFAs)一般指雙鍵數(shù)≥3、碳鏈長度≥20的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA),其中具有重要生理功能的HUFA主要有花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),它們是魚體正常生長發(fā)育的必需脂肪酸。一般認(rèn)為,淡水魚具有將18C亞油酸和α-亞麻酸轉(zhuǎn)化為HUFA的能力,而海水魚的該種能力缺乏或很弱。近年來,本課題組在植食性的黃斑藍子

2、魚(Siganus canaliculatus)中首次發(fā)現(xiàn)和證明海水魚具有 HUFA 合成能力,也在該魚中克隆到脊椎動物中的首個 Δ4脂肪酸去飽和酶(fatty acyl desaturase, fad)基因。目前,黃斑藍子魚所有HUFA合成關(guān)鍵酶的基因已被克隆,這為深入研究其HUFA合成調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。為了探討另外一種食性與黃斑藍子魚相同(植食性)、親緣關(guān)系較近的海水魚—金錢魚(Scatophagus argus)是否也具有相似的

3、HUFA合成系統(tǒng),我們對金錢魚HUFA合成關(guān)鍵酶的基因進行了克隆和功能鑒定,對其組織表達特性和營養(yǎng)調(diào)節(jié)進行了研究。主要結(jié)果如下：
　　1.采用RT-PCR和RACE-PCR方法,從金錢魚中克隆到一個去飽和酶基因,cDNA全長為1972bp,包括237bp的3’非編碼區(qū),397bp的5’非編碼區(qū)以及1338bp的開放閱讀框,編碼445個氨基酸。氨基酸序列與已克隆的魚類Δ6或Δ5脂肪酸去飽和酶具有70％?85%相似性,且具有典型的脂肪

4、酸去飽和酶的結(jié)構(gòu)特性。經(jīng)功能鑒定,該基因的表達產(chǎn)物僅具有Δ6去飽和酶活性,故為Δ6fad基因(GenBank登錄號:KC508796)。
　　2.克隆到兩個碳鏈延長酶(Elongases of very long-chain fatty acids, 簡寫為elovl)基因。一個延長酶的cDNA全長為1484bp,具有918bp開放閱讀框,編碼305個氨基酸。氨基酸序列與已克隆的魚類碳鏈延長酶具有69%?97%相似性,且具有典型的

5、碳鏈延長酶的結(jié)構(gòu)特性。經(jīng)功能鑒定,該基因的表達產(chǎn)物表現(xiàn)出典型的elovl4活性,故為elovl4基因(GenBank登錄號:KF029624)。另一個延長酶的cDNA全長為1390bp,具有885bp的開放閱讀框,編碼294個氨基酸。氨基酸序列與已克隆的魚類碳鏈延長酶具有71%?84%相似性,且具有典型的碳鏈延長酶的結(jié)構(gòu)特性。經(jīng)功能鑒定,該基因的表達產(chǎn)物表現(xiàn)出典型的elovl5活性,故為elovl5基因(GenBank登錄號:KF029

6、625)。
　　3.采用RT-PCR檢測上述三個基因的組織表達特性,Δ6fad和elovl5在肝臟和腦中表達量最高,其次為腸和眼,而在脂肪組織、脾、肌肉、心臟和鰓等組織的表達水平較低。elovl4在眼睛中的表達量最高,在肝臟、腦、腸、脂肪組織、脾、肌肉、心臟和鰓等組織的表達水平極低或難以檢測到。這說明,肝臟、腦和眼可能是金錢魚HUFA合成的主要部位。
　　4.采用Real-timePCR方法檢測以不同脂肪源飼料養(yǎng)殖的金錢魚肝

7、臟/眼中的HUFA合成關(guān)鍵酶基因的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與魚油飼料組魚(對照組)相比,各植物油(含不同比例豆油和蘇籽油)飼料組魚的去飽和酶及碳鏈延長酶的基因表達水平都有上調(diào),說明植物油能促進其mRNA表達。
　　綜上所述,本研究從金錢魚中克隆到三個HUFA合成關(guān)鍵酶基因,即Δ6fad、elovl5和elovl4。這些基因在肝臟、腦和眼等組織中的表達水平較高,說明其可能是金錢魚HUFA合成的主要部位。飼料植物油對HUFA合成關(guān)鍵酶基因