金銀花綠原酸合成途徑關(guān)鍵酶基因克隆與功能分析.pdf

1、綠原酸是金銀花在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的重要次生代謝產(chǎn)物，近年來隨著金銀花研究的不斷深入，綠原酸的含量、合成機制及有效地開發(fā)利用成為了生物化學(xué)、分子生物學(xué)以及代謝工程研究領(lǐng)域的一個熱點。為了能有效地提高金銀花綠原酸含量，本研究從基因克隆、基因結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)預(yù)測、基因表達(dá)等不同的方面對金銀花綠原酸生物合成過程中重要的三個關(guān)鍵酶基因進(jìn)行了相關(guān)研究，既為研究金銀花綠原酸的生物合成機制奠定基礎(chǔ)，也為基因工程在代謝工程的應(yīng)用提供一定的借鑒。本

2、論文的主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)采用RT-PCR及RACE方法從金銀花中分離到綠原酸合成緊密相關(guān)的LjHCT、LjC3H1及LjCCoA OMT1基因的全長CDS序列，LjHCT基因CDS全長1293，編碼430個氨基酸，LjC3H1基因CDS全長1533，編碼510個氨基酸，LjCCoA OMT1基因CDS全長744，編碼267個氨基酸。通過對不同物種三個基因的親緣關(guān)系分析，顯示金銀花LjHCT基因與桔梗與刺苞菜薊HCT

3、基因相似性最高，金銀花LjC3H1基因與咖啡和紅車軸草C3H1基因相似性最高，金銀花LjCCoA OMT1基因與羊奶參和光皮樺的CCoA OMT1基因相似性較高，這三個基因與木本植物的相似性要高于草本植物。通過跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測分析，LjC3H1蛋白有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，而其他兩個蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。通過亞細(xì)胞定位分析顯示LjHCT蛋白可能在葉綠體或線粒體上發(fā)揮作用，LjC3H1蛋白可能在葉綠體上發(fā)揮作用，LjCCoAOMT1蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)

4、中發(fā)揮作用。通過疏/親水性分析結(jié)果顯示，三個蛋白全為親水性蛋白。二級結(jié)構(gòu)分析顯示三個蛋白都主要以α-螺旋與不規(guī)則盤繞為主。通過氨基酸保守序列分析顯示LjHCT蛋白包含有轉(zhuǎn)移酶的保守序列，LjC3H1蛋白包含有細(xì)胞色素P450的保守序列，LjCCoAOMT1蛋白包含有甲基轉(zhuǎn)移酶的保守序列。并構(gòu)建了三種蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型。
　　 (2)分析了金銀花開花期綠蕾、白蕾、白花、黃花、幼葉、老葉、幼莖與莖皮中綠原酸含量，結(jié)果顯示，綠原酸含量

5、最高的部位是綠蕾，為干重的2.95％，老葉，幼葉中綠原酸含量較低，僅為0.20％和0.41％。通過熒光定量PCR的方法，對金銀花不同部位相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，LjHCT, LjC3H1與LjCCoA OMT1基因在金銀花不同組織中廣泛表達(dá)，但表達(dá)水平各有差異。LjHCT基因在白花相對表達(dá)量最高，白蕾中相對表達(dá)量最低，白花中相對表達(dá)量是白蕾中的400倍。LjC3H1基因在黃花相對表達(dá)量最高，老葉中相對表達(dá)量最低，黃花中相對表

6、達(dá)量是老葉中的20.5倍。LjCCoA OMT1基因在綠蕾相對表達(dá)量最高，在白蕾相對表達(dá)量最低，綠蕾中相對表達(dá)量是白蕾的439.1倍，表明LjCCoA OMT1基因雖然在不同組織中都有表達(dá)，但表達(dá)差異極為顯著。LjCCoA OMT1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)前期減少，后期又增加的趨勢。
　　 (3)利用大腸桿菌BL21對LjHCT，LjC3H1與LjCCoA OMT1基因所編碼的蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，并采用鎳柱純化的方法得到了三種可溶性重組

7、蛋白，我們將融合蛋白用考馬斯亮蘭染色的方法，檢測到Pcold-LjHCT融合蛋白大小約為92kDa，pCOLD-LjCCoAOMT1蛋白大小為72kDa，pCOLD-LjC3H1蛋白大小為102kDa。金銀花開花期不同組織綠原酸含量與LjHCT, LjC3H1及LjCCoA OMT1基因表達(dá)量的相關(guān)關(guān)系研究表明，LjCCoA OMT1基因的表達(dá)與綠原酸含量有顯著的相關(guān)性，而LjC3H1與LjHCT基因的表達(dá)與綠原酸含量的相關(guān)性沒有達(dá)到顯

8、著水平。LjHCT與LjC3H1基因的表達(dá)呈一定負(fù)相關(guān)性，但沒有達(dá)到顯著水平，這可能與LjHCT催化p-香豆酰輔酶A變成p-香豆?？崴峄騪-香豆酰莽草酸的反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)的有關(guān)。采用HPLC檢測底物含量變化的方法鑒定了pCOLD-LjCCoAOMT1重組蛋白能催化咖啡酸甲基化生成阿魏酸。
　　 (4)構(gòu)建了LjHCT，LjC3H1及LjCCoA OMT1三個基因的YFP的融合表達(dá)載體，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，進(jìn)行了亞細(xì)胞定位

9、研究，結(jié)果表明LjHCT與歷CCoAOMT1在細(xì)胞中各部位都有表達(dá)，其中LjHCT主要在細(xì)胞器上，LjCCoAOMT1主要在細(xì)胞質(zhì)中，而LjC3H1蛋白僅在細(xì)胞器上有表達(dá)，結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果基本一致。構(gòu)建了 LjCCoAOMT1基因的pCAMBIA-1301-LjCCoA OMT1植物表達(dá)載體，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因水稻與野生型在株高、穗長、葉長、葉寬與千粒重方面沒有明顯的差異，而分蘗數(shù)和每穗

10、粒數(shù)有顯著性差異。
　　 (5)通過不同光照和赤霉素(GA3)處理金銀花幼苗、轉(zhuǎn)LjCCoAOMT1基因水稻和野生型水稻，進(jìn)行了環(huán)境條件對LjCCoA OMT1基因表達(dá)特性影響的研究。結(jié)果顯示在黑暗條件下，金銀花幼苗出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因水稻比野生型水稻黃化現(xiàn)象更為嚴(yán)重，但轉(zhuǎn)至藍(lán)光下培養(yǎng)后，金銀花幼苗轉(zhuǎn)綠，轉(zhuǎn)LjCCoA OMT1基因水稻比野生型水稻葉片轉(zhuǎn)綠快，表明轉(zhuǎn)基因水稻對光照條件的變化比野生型水稻要敏感。熒光定量PCR分析發(fā)

11、現(xiàn)，金銀花LjCCoA OMT1在暗處理后和藍(lán)光處理后比在自然光下的表達(dá)量顯著增加，轉(zhuǎn)基因水稻Os CCoA OMT1基因在暗處理后和藍(lán)光處理后比在自然光下的表達(dá)量同樣增強，分析表明，在不同光照條件下金銀花LjCCoAOMT1與水稻Os CCoA OMT1基因表達(dá)模式基本一致。不同濃度的赤霉素對金銀花幼苗、轉(zhuǎn)LjCCoA OMT1基因水稻和野生型水稻處理結(jié)果顯示，短期噴施赤霉素，對金銀花幼苗株高生長的促進(jìn)效果不明顯，但赤霉素能夠有效地促

12、進(jìn)轉(zhuǎn)LjCCoA OMT1基因水稻和野生型水稻快速生長，隨著赤霉素濃度的提高，效果越好，轉(zhuǎn)LjCCoA OMT1基因水稻與野生型水稻相比，前者增長速度更快，當(dāng)赤霉素濃度由200 mg/L增大至400 mg/L時，對水稻Os CCoA OMT1基因表達(dá)的促進(jìn)作用已不太明顯，而對轉(zhuǎn)LjCCoAOMT1基因水稻中OsCCoAOMT1基因的促進(jìn)作用仍很明顯。定量PCR檢測分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)赤霉素濃度由200 mg/L增大至400mg/L，金銀花幼苗L

13、jCCoA OMT1基因表達(dá)量分別為對照(0 mg/L)的1.7倍和1.8倍，而在轉(zhuǎn)基因水稻中OsCCoA OMT1基因表達(dá)量分別為對照(0 mg/L)的2.4倍和3.6倍，分析表明，金銀花LjCCoAOMT1基因與水稻OsCCoAOMT1基因表達(dá)模式基本一致，并且在轉(zhuǎn)LjCCoA OMT1基因水稻中，由于LjCCoA OMT1基因的過量表達(dá)及Os CCoA OMT1基因的協(xié)同表達(dá)，高濃度的赤霉素也能有效地發(fā)揮其生理作用。
　　

14、 (6)本研究成功地建立了金銀花組培快繁技術(shù)體系，金銀花組培最合適的外植體是幼莖，適合金銀花愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA2.0 mg/L+KT0.5 mg/L+NAA1.0 mg/L培養(yǎng)基，適合金銀花叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為WPM+6-BA2.0 mg/L+KT2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L，適合金銀花叢生芽生根的培養(yǎng)基為WPM+NAA0.1 mg/L+活性炭150 mg/L。以金銀花幼莖為外植體，成功地建立了金銀花

15、愈傷組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)體系，并成功地將金銀花LjCCoA OMT1基因?qū)霊腋〖?xì)胞。在金銀花懸浮細(xì)胞中，采用熒光定量PCR的方法檢測LjC3H1，LjCCoA OMT1和LjHCT的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，LjCCoA OMT1基因在轉(zhuǎn)基因愈傷中過量表達(dá)，表達(dá)量是未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷中LjCCoA OMT1基因表達(dá)量的4.2倍，LjC3H1基因在轉(zhuǎn)化LjCCoAOMT1基因的愈傷中協(xié)同表達(dá)，表達(dá)量略有增加，但LjHCT基因在轉(zhuǎn)化LjCC