PmrA對傷寒沙門菌高滲應(yīng)激后期基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的: PmrA為傷寒沙門菌雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)的效應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，在高滲應(yīng)激的后期其基因表達(dá)明顯下調(diào)。本研究的目的是進(jìn)一步探討傷寒沙門菌調(diào)節(jié)因子PmrA在高滲應(yīng)激后期對基因表達(dá)調(diào)節(jié)的影響。 方法: (1)傷寒沙門菌pmrA基因缺陷變異株制備：采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌調(diào)節(jié)因子PmrA的基因缺陷變異株，根據(jù)傷寒沙門菌pmrA基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增pmrA基因上、下游同源性片段，定向連接成pm

2、rA基因缺損型同源核苷酸片段，并與自殺質(zhì)粒pGMB151相連后經(jīng)電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，在5％蔗糖LB平板上進(jìn)行同源重組，通過篩選獲得pmrA基因缺陷變異株； (2)傷寒沙門菌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析：利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù)，體外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激，在低滲(50mmol/LNaCl)LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株和pmrA基因缺陷變異株4h(37℃，250r/min)至對數(shù)生長期，后轉(zhuǎn)入高滲(300mmol/LNa

3、Cl)LB培養(yǎng)液中在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在高滲應(yīng)激后期(120min)，分別提取傷寒沙門菌野生株和pmrA基因缺陷變異株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片雜交，掃描后據(jù)熒光信號分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，比較傷寒沙門菌野生株和pmrA基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激后期的基因表達(dá)譜差異； (3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT—PCR)分析：選擇部分表達(dá)差異顯著的基因，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PC

4、R，驗(yàn)證DNA芯片分析結(jié)果。 結(jié)果: (1)PCR及序列分析證實(shí)，pmrA基因缺陷變異株中pmrA基因351bp被6bp取代，表明成功構(gòu)建pmrA基因缺陷變異株； (2)基因表達(dá)譜比較分析結(jié)果表明傷寒沙門菌pmrA基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激后期有81個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，有22個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。其主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白、鞭毛蛋白、侵襲蛋白、外膜蛋白及一些酶類等； (3)對pmrA基因缺陷變異株中表達(dá)差異基因