RpoE在傷寒沙門菌克服環(huán)境高滲應激中的基因表達調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種重要的人類腸道致病菌，是目前研究最為廣泛和深入的原核生物之一。傷寒沙門菌常通過污染食物經(jīng)消化道入體內(nèi)，在空腸遠端入侵腸上皮細胞，并進一步在局部腸系膜淋巴組織中存活和增殖，再經(jīng)淋巴液和血液進入肝、脾等全身組織，造成全身性感染并能引發(fā)腸穿孔等嚴重的并發(fā)癥從而危及患者生命。
　　 作為人類食源性致病菌，傷寒沙門菌在從環(huán)境到使宿主致病的

2、過程中，需要遇到一系列劇烈的環(huán)境應激，包括人的腸道高滲應激環(huán)境。在高滲應激條件下，細菌需要及時有效地調(diào)節(jié)某些基因的表達和蛋白的活性來適應環(huán)境。原核生物基因表達均是由sigma因子介導轉(zhuǎn)錄起始，且多數(shù)呈操縱子模式，并受各種調(diào)節(jié)因子的影響。不同的sigma因子(σ因子)特異性識別并引導RNA聚合酶結合到目的基因啟動子區(qū)域，啟動相應基因表達，無疑是原核生物對其生命活動進行調(diào)控的最基本的方式。已知不同的sigma因子的作用不同，不同的sigma

3、因子對某些基因或有共調(diào)節(jié)作用，但缺乏直接的研究證據(jù)。RpoE是響應環(huán)境應激的sigma因子。已有研究發(fā)現(xiàn)RpoE是腸桿菌科細菌中一個重要的sigma因子，在響應多種環(huán)境應激時發(fā)揮著重要作用，對細菌生存和致病性至關重要，但其在傷寒沙門菌中作用的研究報道尚少。
　　 目的：本研究旨在了解與RpoE相關的參與傷寒沙門菌克服高滲應激的效應蛋白基因，深入分析RpoE對重要致病因子表達調(diào)控的機制，研究RpoE在傷寒沙門菌克服高滲應激過程中與

4、另一sigma因子RpoS對基因表達的共調(diào)節(jié)作用，以加深對傷寒沙門菌基因表達調(diào)控網(wǎng)絡和致病分子機制的認識。
　　 方法：
　　 (1)基因缺陷變異株的制備采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導的同源重組方法，制備傷寒沙門菌rpoS缺陷變異株及rpoE/rpoS雙缺陷變異株。
　　 (2)rpoE基因缺陷回補株的構建PCR擴增rpoE基因，酶切后與表達載體pBAD/gⅢ定向連接，熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)

5、序列分析鑒定后，電擊法轉(zhuǎn)入rpoE基因缺陷變異株。
　　 (3)高滲應激下生長情況分析以生長時間為橫坐標，細菌OD600值為縱坐標繪制生長曲線，對比缺陷變異株、野生株及基因缺陷回補株在高滲應激條件下的生長情況。
　　 (4)動力試驗分析缺陷變異株和野生株37℃培養(yǎng)過夜，分別取4μl菌液接種于0.3％高滲半固體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8小時后測量動力圈直徑，觀察缺陷株及野生株的動力。
　　 (5)傷寒沙門菌基因表達譜

6、分析傷寒沙門菌全基因組芯片分析目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上對其他基因的表達調(diào)控。體外模擬高滲環(huán)境應激后分別提取傷寒沙門菌野生株和基因缺陷變異株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標記熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片雜交，掃描后根據(jù)熒光信號分析各基因轉(zhuǎn)錄表達水平，比較傷寒沙門菌野生株和基因缺陷變異株在高滲應激早期的基因表達譜差異。
　　 (6)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析選擇基因芯片結果中部分差異表達基因，設計特異性引物，進行反

7、轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR，以驗證DNA芯片分析結果。
　　 (7)蛋白質(zhì)二維電泳和質(zhì)譜分析高滲應激后分別提取rpoE缺陷變異株和野生株的菌體蛋白和分泌蛋白。取適量蛋白進行等點聚焦和SDS-PAGE電泳分離后，以考馬斯亮藍G-250染色后掃描成像，分析蛋白表達差異，選取明顯表達差異蛋白進行質(zhì)譜分析；質(zhì)譜分析的肽指紋圖在www.mascot進行比對。
　　 (8)Western免疫印跡分析分泌蛋白高滲應激條件培養(yǎng)rpoE缺陷株、

8、野生株，利用三氯醋酸-丙酮法提取培養(yǎng)上清中的分泌蛋白，以抗H：z66多克隆抗體進行Western免疫印跡分析rpoE缺陷株、野生株分泌Z66蛋白的差異。
　　 (9)凝膠阻滯試驗根據(jù)傷寒沙門菌rpoE基因序列設計引物，擴增rpoE基因片段，與表達載體pET-28a連接經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，用IPTG誘導表達RpoE蛋白，用鎳柱純化RpoE蛋白。根據(jù)傷寒沙門菌fliA基因序列設計特異性引物，擴增fliA基因啟動子區(qū)域，

9、取2μg PCR產(chǎn)物與不同濃度的RpoE蛋白混合，加入相應體積的GSM緩沖液，反應總體積為20μl，30℃孵育15 min。選取真核生物DNA片段作為陰性對照，8％的丙烯酰胺膠電泳分離條帶，溴化乙錠染色。
　　 (10)HeLa細胞侵襲試驗細菌培養(yǎng)至OD600為1.0，加入培養(yǎng)有HeLa細胞的24孔板中(MOI=20)，90 min后收集一部分細胞，加入裂解液，涂LB平板過夜培養(yǎng)，計細菌克隆數(shù)，代表細菌粘附細胞水平T0；另一部分

10、加入慶大霉素殺死胞外細菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min，裂解細胞后涂板過夜培養(yǎng)，計克隆數(shù)代表細菌的侵襲水平T90，用T90/T0的值代表細菌的侵襲力。
　　 結果：
　　 (1)研究用菌株制備經(jīng)PCR及序列分析證實成功構建傷寒沙門菌rpoS基因缺陷變異株、rpoE/rpoS雙缺陷變異株；成功構建pBAD-rpoE陽性重組載體，并成功將重組載體導入相應的缺陷株中，制備成rpoE基因缺陷回補株。
　　 (2)生長曲線分析結果

11、顯示rpoE基因缺陷變異株在高滲應激條件下生長能力明顯弱于野生株，在回補rpoE基因后得到明顯恢復；rpoS基因缺陷株在高滲應激條件下生長能力亦明顯弱于野生株，rpoE/rpoS雙缺陷變異株在高滲應激條件下生長能力均明顯弱于野生株和rpoE、rpoS單基因缺陷株。
　　 (3)高滲應激下RpoE影響基因表達分析基因組芯片分析顯示，高滲應激30分鐘后，rpoE基因缺陷株相比野生株有74個基因表達下調(diào)，56個基因表達上調(diào)，選取其中部

12、份差異表達基因利用RT-PCR進行驗證，結果顯示所選基因表達變化與基因芯片分析結果基本一致，且在回補rpoE基因后表達得到明顯恢復。
　　 (4)高滲應激下RpoE對蛋白表達影響的分析二維電泳、質(zhì)譜分析顯示，rpoE缺陷株與野生株相比18個菌體蛋白明顯有差異，質(zhì)譜分析鑒定包括有氨酰組氨酸二肽酶PepD、氨酰組氨酸二肽酶AspA等；分泌蛋白二維電泳后發(fā)現(xiàn)rpoE缺陷株與野生株相比有16個明顯差異點，質(zhì)譜分析鑒定包括NAD合成酶Na

13、dE，外膜蛋白OmpC等。
　　 (5)RpoE對鞭毛及動力影響機制研究動力試驗結果顯示，在高滲半固體LB培養(yǎng)平板上，rpoE基因缺陷變異株動力比野生株明顯下降，回補rpoE基因后動力明顯恢復，提示RpoE在高滲條件下參與調(diào)控鞭毛動力；結合高滲應激早期基因芯片發(fā)現(xiàn)rpoE缺陷變異株中二級鞭毛基因fliA和三級鞭毛基因表達明顯下調(diào)，利用qRT-PCR分析一級鞭毛基因flhD、二級鞭毛基因fliA和三級鞭毛基因fljB：z66的表達

14、情況發(fā)現(xiàn)，rpoE缺陷變異株中flhD相比野生株沒有明顯差異，而fliA與fljB：z66的表達在rpoE缺陷變異株中明顯下調(diào)；Western-bolt發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白FljB：z66在rpoE缺陷變異株的表達明顯低于野生株；凝膠阻滯試驗證實RpoE蛋白可以直接結合fliA基因啟動子。
　　 (6)RpoE對傷寒沙門菌侵襲力影響分析 rpoE基因缺陷變異株的侵襲力比野生株明顯下降，而rpoE回補株侵襲能力明顯恢復；結合基因芯片結果，

15、挑選部分侵襲毒力相關基因進行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)這些基因在rpoE缺陷株中表達相對野生株明顯下調(diào)，在回補rpoE基因后表達明顯恢復。
　　 (7)高滲應激下RpoE和RpoS對基因表達的共調(diào)節(jié)分析利用基因組芯片，進一步分析rpoE基因缺陷株表達譜、rpoS基因缺陷株表達譜和rpoE/rpoS雙缺陷株表達譜，發(fā)現(xiàn)有38個基因，包括osmC、osmY、otsBA、narUZY、dpS等，在rpoE、rpoS缺陷株中相比野生株表達變化

16、不明顯，但在rpoE/rpoS雙缺陷株表達明顯下調(diào)，提示這些基因受RpoE與RpoS的雙重調(diào)控；選取不同操縱子的6個基因(osmC，osmY，otsB，narU，ugpB和dps)進行qRT-PCR進行驗證，結果顯示，所選基因表達與基因芯片分析結果一致。
　　 結論：
　　 (1)RpoE在傷寒沙門菌高滲應激時參與fliA、flgK、cheW、glpX、ompC、phoP等致病因子基因的表達調(diào)控。
　　 (2)高