傷寒沙門(mén)菌Mig-14抵抗多粘菌素B殺傷機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　mig-14是沙門(mén)菌屬水平轉(zhuǎn)移獲得的毒力基因，在沙門(mén)菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B（簡(jiǎn)稱(chēng)PB）的殺傷作用等方面有著重要作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本論文旨在研究Mig-14參與傷寒沙門(mén)菌抵抗PB殺傷的分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1)多粘菌素B作用下mig-14基因表達(dá)譜分析體外普通LB中加入PB致終濃度為0.1μg/ml，分別培養(yǎng)傷寒沙門(mén)菌野生株（WT）和mig-14基因缺陷變異株（△mig-14）5 h

2、（37 oC，250 r/min）后，提取WT和△mig-14的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光（cy3或cy5），與基因組芯片雜交，掃描后據(jù)熒光信號(hào)分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，比較WT和△mig-14在PB作用下的基因表達(dá)譜差異；選擇部分差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，驗(yàn)證DNA芯片分析結(jié)果。
　　(2) WT與△mig-14的OmpC::3×Flag，OmpF::3×Flag標(biāo)簽融合菌株制備采用自殺質(zhì)粒pGMB1

3、51介導(dǎo)的同源片段重組方法，在傷寒沙門(mén)菌WT與△mig-14的ompC、ompF基因的終止密碼子前分別插入3×Flag標(biāo)簽，制備WT-OmpC::3×Flag、WT-OmpF::3×Flag標(biāo)簽變異菌株，△mig-14-OmpC::3×Flag、△mig-14-OmpF::3×Flag標(biāo)簽變異菌株。
　　(3) Western Blot免疫印跡法檢測(cè)WT和△mig-14中OmpF和OmpC的表達(dá)量PB刺激條件下培養(yǎng) WT-OmpC

4、::3×Flag、WT-OmpF::3×Flag標(biāo)簽變異菌株與△mig-14-OmpC::3×Flag、△mig-14-OmpF::3×Flag標(biāo)簽變異菌株，收集全菌蛋白，以抗Flag單克隆抗體進(jìn)行Western Blot免疫印跡分析WT與△mig-14變異株孔道蛋白OmpC、OmpF表達(dá)的差異。
　　(4)基因缺陷變異株的制備采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門(mén)菌各基因缺陷變異株。根據(jù)S. Typhi的ompC基因堿基序列

5、，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并在5′末端加上BamH I的特異性酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增ompC基因片段，利用粘性末端特性連接成ompC基因的不完全同源性核苷酸片段。膠回收后熱擊入E. coli，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，然后電轉(zhuǎn)導(dǎo)入傷寒沙門(mén)菌野生株WT、ompF缺陷株（簡(jiǎn)稱(chēng)△ompF）（實(shí)驗(yàn)室保存）、mig-14缺陷株（簡(jiǎn)稱(chēng)△mig-14）（實(shí)驗(yàn)室保存），進(jìn)行同源重組。用PCR觀察重組現(xiàn)象，將相應(yīng)完全重組的菌株作為ompC基因的缺陷變異株、ompC/ompF、mig-

6、14/ompC雙缺陷變異株（分別簡(jiǎn)稱(chēng)△ompC，△ompC/ompF、△mig-14/ompC）。將本實(shí)驗(yàn)室保存的含ompF同源缺失片段的陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至△mig-14和△mig-14/ompC，進(jìn)行同源重組，制備 mig-14/ompF及mig-14/ompC/ompF三缺陷變異株（分別簡(jiǎn)稱(chēng)為△mig-14/ompF、△mig-14/ompC/ompF），并通過(guò)PCR及序列分析鑒定技術(shù)加以確定。
　　(5)各菌株抵抗PB殺傷能力分

7、析以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間，OD600吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)比各個(gè)基因缺陷變異株與野生株在PB殺傷作用下的生存情況。
　　(6) Mig-14對(duì)生物膜形成能力的影響把野生株、△mig-14、△mig-14（空pBAD）、△mig-14回補(bǔ)株分別培養(yǎng)至OD6000.6后取等量的菌放置96孔板30 oC靜置培養(yǎng)3天后，甲醇30分鐘固定，結(jié)晶紫對(duì)生物膜染色，用乙酸溶解后酶標(biāo)儀測(cè)定OD570紫外吸收值，紫外吸收值代表生物膜生成量，比較

8、傷寒沙門(mén)菌WT與△mig-14生物膜生成能力。
　　結(jié)果：
　　(1) PB刺激下Mig-14基因表達(dá)譜分析基因表達(dá)譜比較分析結(jié)果表明，與野生株相比傷寒沙門(mén)菌mig-14基因缺陷變異株在PB刺激5小時(shí)后，有768個(gè)基因表現(xiàn)出明顯的表達(dá)差異。其中，鞭毛相關(guān)基因、外膜孔道蛋白相關(guān)基因ompC、ompF表達(dá)上調(diào)、侵襲和毒力相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，與基于DNA芯片的基因表達(dá)譜分析數(shù)據(jù)相比，兩者變化情況趨勢(shì)一致。<

9、br>　　(2) WT與△mig-14的OmpC::3×Flag，OmpF::3×Flag標(biāo)簽融合菌株制備經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)成功在傷寒沙門(mén)菌WT與△mig-14缺陷株的ompC、ompF基因終止密碼子前插入3×Flag標(biāo)簽，成功制備WT-OmpC::3×Flag，WT-OmpF::3×Flag融合標(biāo)簽變異株以及△mig-14-OmpC::3×Flag，△mig-14-OmpF::3×Flag融合標(biāo)簽變異株。
　　(3) Wes

10、tern Blot免疫印跡法分析WT和△mig-14中OmpF和OmpC的表達(dá)差異Western-bolt結(jié)果顯示，相比于WT在PB刺激下△mig-14的孔道蛋白OmpC，OmpF表達(dá)量明顯增多。
　　(4)基因缺陷變異株的制備經(jīng)序列鑒定技術(shù)分析證實(shí)成功構(gòu)建傷寒沙門(mén)菌△ompC、△ompC/ompF、△mig-14/ompC、△mig-14/ompF、△mig-14/ompC/ompF變異株。
　　(5)各菌株抵抗PB殺傷能

11、力分析結(jié)果顯示△mig-14生存能力明顯弱于 WT，而且△mig-14/ompF、△mig-14/ompC及△mig-14/ompC/ompF生存能力強(qiáng)于△mig-14。
　　(6) Mig-14對(duì)傷寒沙門(mén)菌生物膜形成能力的影響生物膜試驗(yàn)結(jié)果顯示△mig-14缺陷的情況下，相比于WT生物膜形成能力降低。
　　結(jié)論：
　　PB刺激條件下，傷寒沙門(mén)菌Mig-14可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。mig-14缺失后，ompC及ompF的