OsmY對傷寒沙門菌高滲應(yīng)激早期基因表達調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:
　　 OsmY是傷寒沙門菌中的一個周質(zhì)蛋白,在許多腸道菌環(huán)境高滲應(yīng)激后都會有明顯的表達增加,且有跡象表明sigma因子RpoE和RpoS均可調(diào)控其表達,提示其在腸道菌應(yīng)答環(huán)境高滲應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用,因此本研究擬進一步研究傷寒沙門菌中OsmY在高滲應(yīng)激早期對系統(tǒng)基因表達的影響及作用。
　　 方法:
　　 1.傷寒沙門菌osmY,缺陷變異株的制備:采用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組方法制備目的基因缺陷變異株。根據(jù)

2、目的基因序列設(shè)計特異性引物來擴增上下游同源片段,定向連接,酶切后插入自殺質(zhì)粒pGMB151中,將篩選出的陽性質(zhì)粒經(jīng)電擊轉(zhuǎn)入傷寒沙門菌野生菌,進行同源重組篩選含目的片段的菌株,最后經(jīng)序列分析鑒定。
　　 2.osmY,基因缺陷回補株的構(gòu)建:以傷寒沙門菌基因組DNA為模板PCR擴增回補目的基因,酶切后與表達載體pBAD/gⅢ定向連接,將篩選出含目的片段的質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中篩選陽性質(zhì)粒,經(jīng)序列分析鑒定后,轉(zhuǎn)入相應(yīng)的os

3、mY,基因缺陷變異株中,同時將pBAD空載體熱擊導(dǎo)入osmY,基因缺陷變異株中作為對照菌株。
　　 3.生長曲線的測定:以生長時間為橫坐標(biāo),細(xì)菌OD600值為縱坐標(biāo),繪制在高滲的條件下,野生株與缺陷株生長曲線。
　　 4.動力試驗分析:在高滲的半固體培養(yǎng)基上觀察野生株、osmY,缺陷變異株的動力情況。
　　 5.傷寒沙門菌基因表達譜分析:利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù),比較傷寒沙門菌野生株與osmY基因缺陷變

4、異株在高滲應(yīng)激的條件下表達譜差異。體外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激,在低滲(50 mmol/LNaCl)LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傷寒沙門菌野生株和osmy基因缺陷變異株4h(37℃,250r/min)至對數(shù)生長期,后轉(zhuǎn)入高滲(300 mmol/LNaCl)LB培養(yǎng)液中以同樣條件繼續(xù)培養(yǎng),在高滲應(yīng)激早期(30min),分別提取傷寒沙門菌野生株和osmY基因缺陷變異株的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA并配對標(biāo)記熒光(cy3或cy5),與基因組芯片雜交,掃描后根據(jù)

5、綜合熒光信號分析各基因轉(zhuǎn)錄表達水平,比較傷寒沙門菌野生株和osmY基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激早期的基因表達譜差異。
　　 6.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析:為了驗證DNA芯片結(jié)果,選擇不同操縱子的部分基因芯片差異明顯的基因,設(shè)計特異性引物進行實時定量PCR。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)PCR及序列分析證實,變異株中osmY基因編碼區(qū)缺失了366個堿基,表明成功構(gòu)建傷寒沙門菌osmY基因缺陷變異株。

6、>　　 2.PCR及序列分析結(jié)果表明,成功構(gòu)建pBAD-osmY陽性重組載體,已將陽性載體及空載體分別熱擊導(dǎo)入相應(yīng)的缺陷株中。
　　 3.生長曲線結(jié)果表明傷寒沙門菌osmY基因缺陷變異株在高滲條件下生存能力與野生株無明顯的差異。
　　 4.動力試驗結(jié)果顯示,在高滲的情況下,osmY基因缺陷株動力相比野生株明顯下降。
　　 5.基因芯片分析結(jié)果顯示,在高滲應(yīng)激條件下,傷寒沙門菌osmY基因缺陷變異株與野生株相比,