環(huán)丙沙星壓力下鼠傷寒和腸炎沙門菌的適應(yīng)性研究.pdf

1、非傷寒沙門菌是最常見的食源性和水源感染的重要病原菌。隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn)和日益增多，耐藥菌可隨著食物鏈從動(dòng)物擴(kuò)散到人類，對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的威脅。氟喹諾酮類藥物因其獨(dú)特的抗菌機(jī)理和廣譜的抗菌療效，被用作治療沙門菌感染的首選藥物。然而隨著這類藥物的長期和廣泛使用，其耐藥性也隨之快速產(chǎn)生，成為臨床治療的極大負(fù)擔(dān)。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期流行病學(xué)調(diào)查研究表明，養(yǎng)殖場(chǎng)普遍流行的沙門菌優(yōu)勢(shì)血清型為鼠傷寒型，且表現(xiàn)出對(duì)氟喹諾酮類、頭孢菌

2、素類等藥物的多重耐藥表型。因此在耐藥發(fā)展過程中，優(yōu)勢(shì)血清型沙門氏菌是否具有低適應(yīng)性代償而得以普遍流行并在環(huán)境中持續(xù)存在？為了解釋這一現(xiàn)象，本研究篩選了從養(yǎng)殖場(chǎng)分離到的兩種（鼠傷寒型和腸炎型）血清型沙門菌，在不同環(huán)丙沙星壓力下進(jìn)行誘導(dǎo)獲得逐步耐藥突變株，從耐藥發(fā)展過程、菌株的生長能力、不同血清型菌株間的競(jìng)爭(zhēng)能力、及在不同濃度膽鹽脅迫下菌株的生存能力和侵襲能力等幾個(gè)方面來探討這兩種血清型的沙門菌在環(huán)丙沙星選擇壓力下的適應(yīng)性差異。
　　

3、在不同培養(yǎng)條件下，逐步篩選出耐環(huán)丙沙星的鼠傷寒和腸炎型沙門菌的突變株。采用二倍瓊脂稀釋法測(cè)定各突變株的MIC，并且采用 PCR的方法檢測(cè)喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA、gyrB、parC、parE的突變。結(jié)果顯示這兩種血清型的親本株都沒有發(fā)生QRDR的突變。LB培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，腸炎型沙門菌表現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低時(shí)（MIC,0.125mg/L），gyrB發(fā)生S464F突變，在高水平耐藥時(shí)（MIC,32mg/L）又增加了gyr

4、A的D87A與parE的V461G突變。M9培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，腸炎型沙門菌表現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低時(shí)（MIC,0.125 mg/L）gyrB出現(xiàn)S464F突變，但是高水平耐藥時(shí)（MIC,32mg/L）又增加了gyrA的S83F的突變；對(duì)于鼠傷寒沙門菌，在 LB培養(yǎng)條件下，當(dāng)誘導(dǎo)出現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星敏感性降低表型時(shí)，gyrA發(fā)生G81D的突變，進(jìn)一步誘導(dǎo)后環(huán)丙沙星的MIC達(dá)到16mg/L，在parC額外增加了G78D的突變，隨后該突變位點(diǎn)消失

5、，環(huán)丙沙星的MIC降至4mg/L，即使再增加環(huán)丙沙星誘導(dǎo)濃度，環(huán)丙沙星MIC仍然為4mg/L。但是在M9培養(yǎng)條件下，鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)至環(huán)丙沙星MIC為1mg/L時(shí)，gyrB發(fā)生S464Y的突變，進(jìn)一步誘導(dǎo)至環(huán)丙沙星MIC為4mg/L時(shí)，在gyrA又額外增加了S83Y的突變，但隨后該突變位點(diǎn)消失，即使再增加環(huán)丙沙星誘導(dǎo)濃度，環(huán)丙沙星MIC仍然為1mg/L。
　　利用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)兩種血清型突變株外排泵相關(guān)基因的表達(dá)水平，以確

6、定AcrAB-TolC外排泵是否發(fā)生過表達(dá)以及與其表達(dá)增強(qiáng)相關(guān)的調(diào)控因子。結(jié)果表明腸炎沙門菌耐藥突變株的AcrAB-TolC外排活性增強(qiáng)，而鼠傷寒沙門菌耐藥突變株AcrAB-TolC外排活性沒有明顯改變。腸炎沙門菌中 RamA作為主要的調(diào)控因子對(duì)AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)起到調(diào)控作用。
　　采用滴板法檢測(cè)了不同營養(yǎng)條件下這兩種血清型菌株的生長能力，另外也測(cè)定了在添加了不同濃度膽鹽的情況下兩種血清型菌株的生長能力，以確定這兩種

7、血清型的菌株在不同環(huán)境中的適應(yīng)性生存能力。結(jié)果表明在最初抗生素壓力下，腸炎型沙門菌的生長能力顯著大于鼠傷寒沙門菌；但是隨著抗生素壓力的增加及持續(xù)，鼠傷寒沙門菌耐藥菌株的生長能力顯著大于腸炎沙門菌耐藥菌株。
　　采用焦磷酸測(cè)序法測(cè)定同一誘導(dǎo)壓力下不同耐藥水平的兩種血清型沙門菌的競(jìng)爭(zhēng)能力。結(jié)果表明，對(duì)環(huán)丙沙星敏感的鼠傷寒沙門菌其競(jìng)爭(zhēng)能力弱于腸炎沙門菌，而耐藥的鼠傷寒沙門菌比同一誘導(dǎo)濃度下的腸炎沙門菌更具有競(jìng)爭(zhēng)能力。
　　另外，也

8、測(cè)定了不同膽鹽濃度下，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌對(duì)Hela細(xì)胞侵襲能力的差異。結(jié)果表明，在不加膽鹽和0.1％的膽鹽濃度下，鼠傷寒沙門菌的侵襲能力弱于腸炎沙門菌，但是在1%膽鹽濃度下，鼠傷寒沙門菌的侵襲能力強(qiáng)于腸炎沙門菌。
　　結(jié)論：兩種血清型沙門氏菌耐藥發(fā)展機(jī)制存在差異，鼠傷寒沙門菌在抗生素選擇壓力下耐藥性的獲得除了靶位基因gyrA發(fā)生突變，還與除AcrAB-TolC外的其他外排泵作用有關(guān)；腸炎型沙門菌耐藥性獲得主要是由于AcrAB