沙門菌質(zhì)粒毒力基因SpvB抗體的制備及其對NF-κB通路的影響.pdf

1、目的：
　　沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB編碼產(chǎn)物具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶作用，與細菌毒力關系密切，目前該基因的功能還有很多未知。本研究第一部分通過對沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB進行生物信息學分析、克隆表達并制備相應抗體，為后續(xù)深入研究該基因的功能提供工具和手段。第二部分通過建立沙門菌感染的巨噬細胞模型，研究spvB對NF-κB信號通路相關蛋白IκBα和p65等表達的影響；利用與真核表達載體連接的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SpvB瞬時轉(zhuǎn)染

2、HeLa細胞，進一步分析spvB對NF-κB通路的影響，探討該基因?qū)λ拗骶玖τ绊懙姆肿訖C制。
　　方法：
　　一.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB的原核表達及其抗體的制備
　　1.通過生物信息學軟件分析spvB基因及其編碼的蛋白，選取抗原性較高、易表達的氨基酸序列作為克隆序列。
　　2.根據(jù)spvB基因序列設計引物，以攜帶spvB基因的野生型鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typ

3、himurium，S. typhimurium，STM）為模板，PCR擴增獲得目的片段后與原核表達載體pET-28a連接，將質(zhì)粒pET28a-SpvB轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3）后，IPTG誘導表達并純化。用SpvB蛋白免疫健康小鼠，制備抗SpvB多克隆抗體，Western blot檢測抗體特異性。
　　二．沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對NF-κB信號通路的影響
　　1.以攜帶spvB基因的鼠傷寒沙門菌野生株 STM-W

4、T、消除spvB基因的突變株STM-ΔspvB及回補株STM-c-ΔspvB分別與小鼠腹腔巨噬細胞J774A.1共培養(yǎng)，建立細胞感染模型。Western blot檢測NF-κB通路相關蛋白IκBα和p65等的表達；熒光顯微鏡下觀察p65的核轉(zhuǎn)運；Western blot檢測Caspase-3的活化；比色法測定Caspase-3的活性；免疫共沉淀法檢測IκBα的泛素化水平。
　　2.利用pRL-TK（內(nèi)參質(zhì)粒）、pNFκB-luc（

5、報告基因質(zhì)粒）、pEGFP-N1及pEGFP-N1-SpvB瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，加入TNF-α刺激后，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測spvB對NF-κB通路的影響；利用pEGFP-SpvB真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染HeLa細胞，TNF-α刺激后，Western blot檢測spvB基因?qū)κBα、p65等蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：
　　一.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB抗體的制備
　　1.成功構(gòu)建pET28a-SpvB原

6、核表達重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導結(jié)果顯示，重組蛋白表達且主要存在于包涵體中。
　　2.將純化的SpvB蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體，經(jīng)Western blot驗證該抗體能特異結(jié)合SpvB蛋白。
　　二．沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對NF-κB通路的影響
　　1. Western blot檢測NF-κB通路相關蛋白IκBα和p65的表達，結(jié)果顯示細菌與細胞共培養(yǎng)30 min后，STM-ΔspvB感染組細胞IκBα的表達量顯著

7、低于STM-WT感染組（P<0.01），與STM-c-ΔspvB感染組相比兩組間無顯著性差異（P>0.05）；感染4 h后，STM-ΔspvB感染組IκBα的表達量顯著低于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組（P<0.01）；感染4 h和8 h后，STM-ΔspvB感染組Phospho-p65的表達水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組（P<0.05）。
　　2.熒光顯微鏡下觀察p65的核轉(zhuǎn)運，結(jié)果顯示感染8 h

8、后，STM-ΔspvB感染組細胞核中p65的表達顯著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組。
　　3. Western blot檢測Caspase-3的激活，結(jié)果顯示感染4 h和8 h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組細胞Caspase-3出現(xiàn)明顯的活化；比色法測定Caspase-3的活性，結(jié)果顯示感染4 h和8 h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組細胞Caspase-3活性高于STM-ΔspvB感

9、染組（p<0.01）。
　　4.免疫共沉淀檢測IκBα的泛素化水平，結(jié)果顯示用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞24 h，細菌與細胞共培養(yǎng)4 h后，STM-ΔspvB感染組IκBα的泛素化水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組，而未經(jīng)MG132處理各組間IκBα的泛素化差異不明顯。
　　5.雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測spvB對NF-κB通路的影響，結(jié)果顯示pEGFP-N1或 pEGFP-N1-SpvB瞬時轉(zhuǎn)染

10、HeLa細胞24 h，TNF-α處理后，pEGFP-N1-SpvB轉(zhuǎn)染組NF-κB的激活程度顯著低于pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組（P<0.01）；pRL-TK、pNFκB-luc轉(zhuǎn)染HeLa細胞24 h，三株受試菌感染細胞20 h后，STM-ΔspvB感染組NF-κB的激活程度顯著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染組（P<0.01）。6. Western blot檢測spvB基因?qū)κBα和p65等蛋白表達的影響，結(jié)果顯示利用 pE

11、GFP-N1-SpvB真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染 HeLa細胞，TNF-α處理后，pEGFP-N1-SpvB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Phospho-p65的表達顯著低于pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組（P<0.01）而IκBα的表達顯著高于pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建SpvB原核表達載體，獲得具有抗原性的SpvB蛋白及其多克隆抗體，為后續(xù)深入研究該基因的功能奠定了基礎。
　　2.利用沙門菌感染巨噬細胞和真核