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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述:
第一部分 NF-κB通路影響前列腺癌進(jìn)展的研究
背景:前列腺癌(prostate cancer, PCa)是發(fā)生于前列腺上皮的惡性腫瘤,在老年男性中最常見(jiàn)。世界范圍內(nèi),前列腺癌發(fā)病率位于男性所有惡性腫瘤的第二位,死亡率居第六位。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率相對(duì)較低,但近年來(lái)其發(fā)病率逐漸增高。多項(xiàng)研究提示慢性炎癥在包括前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演重要作用。巨噬細(xì)胞(Macroph
2、age)是腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥細(xì)胞,可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間的直接交流可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向外擴(kuò)散并進(jìn)入血液系統(tǒng),因此巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵因素。
核轉(zhuǎn)綠因子(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)被認(rèn)為是炎癥和免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因素。研究證實(shí)NF-κB在多種惡性腫瘤中處于異常激活狀態(tài),而抑制NF-κB的活性可抑制多種腫瘤的進(jìn)展,提示NF-κB在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)
3、揮重要作用。此外,有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)中重要的整合腫瘤微環(huán)境信號(hào)的調(diào)節(jié)分子。通過(guò)特殊方法去除TAM中NF-κB的作用,可顯著抑制腫瘤的發(fā)展,表明NF-κB是腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的重要信號(hào)通路,可作為治療惡性腫瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。
目的:本研究分別以三種常見(jiàn)的前列腺癌細(xì)胞株(LNCaP, DU145,PC-3)和巨噬細(xì)胞為模型,構(gòu)建共培養(yǎng)體系,觀察巨噬細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響;評(píng)估s
4、msDX對(duì)巨噬細(xì)胞刺激的前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的抑制作用。明確NF-κB在前列腺癌發(fā)展過(guò)程中的作用,并探討smsDX對(duì)前列腺癌中NF-κB可能的調(diào)節(jié)作用。為研究激活腫瘤微環(huán)境somatostatin-NF-κB途徑抑制晚期前列腺癌發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。
方法:PMA刺激THP-1細(xì)胞獲得巨噬細(xì)胞,將巨噬細(xì)胞上清液?jiǎn)为?dú)或加入smsDX,分別與LNCaP, DU145,PC-3細(xì)胞混合培養(yǎng)。用細(xì)胞活力試驗(yàn)(CCK-8 assays
5、)和克隆形成實(shí)驗(yàn)(Clony formation assay)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞增殖的變化。通過(guò)細(xì)胞劃痕(Scratch migration assay)和Transwell遷移侵襲試驗(yàn)(Transwell migration andinvasion assay)評(píng)估前列腺癌細(xì)胞遷移侵襲能力的變化。用裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)觀察smsDX和巨噬細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響,并檢測(cè)裸鼠皮下腫瘤中CD68和NF-κB蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)免疫組化技術(shù)(
6、Immunohistochemistry)分別檢測(cè)前列腺增生,慢性前列腺炎和前列腺癌組織標(biāo)本中CD68和NF-κB蛋白的表達(dá)情況,評(píng)估巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量與NF-κB表達(dá)的關(guān)系。運(yùn)用免疫印跡技術(shù)(Western blot)和免疫熒光(Immunofluorescence)評(píng)估NF-κB的蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)位情況。
結(jié)果:通過(guò)CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力變化,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞體外的增殖和克隆形成,而smsDX可
7、減弱巨噬細(xì)胞刺激的前列腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成的變化。細(xì)胞劃痕和Traswell實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞增強(qiáng)了前列腺癌細(xì)胞體外的遷移侵襲能力,而smsDX可抑制這種作用。進(jìn)一步通過(guò)裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞同樣能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞裸鼠皮下的增殖,而smsDX可以明顯抑制裸鼠皮下的腫瘤體積。檢測(cè)不同前列腺疾病組織標(biāo)本中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)與NF-κB的表達(dá),發(fā)現(xiàn)前列腺癌和慢性前列腺炎組織標(biāo)本中存在較多巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量與NF-κB的激活有一定相
8、關(guān)性。進(jìn)一步檢測(cè)巨噬細(xì)胞和smsDX分別作用后前列腺癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá),發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可上調(diào)NF-κB在前列腺癌細(xì)胞核中的表達(dá),同時(shí)伴隨胞漿中NF-κB下調(diào);smsDX作用則抑制了NF-κB在細(xì)胞核和胞漿中的變化。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)smsDX可以抑制巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)位。
結(jié)論:巨噬細(xì)胞能夠激活NF-κB促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲,smsDX通過(guò)NF-κB途徑抑制腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞對(duì)
9、前列腺癌的刺激作用。研究為smsDX作為聯(lián)合治療前列腺癌中的輔助用藥提供了理論基礎(chǔ)。
研究創(chuàng)新:
通過(guò)本課題研究,加深了腫瘤微環(huán)境中TAM對(duì)前列腺癌進(jìn)展影響的認(rèn)識(shí),進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-κB在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中的重要作用。抑制NF-κB途徑可減弱巨噬細(xì)胞對(duì)前列腺癌的刺激作用,為治療前列腺癌提供了新的思路。
第二部分 AKT-mTOR通路對(duì)前列腺癌進(jìn)展的影響
背景:前列腺癌是老年男性常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病
10、率居我國(guó)男性腫瘤第七位。在臨床上,早期前列腺癌為雄激素依賴性腫瘤,對(duì)內(nèi)分泌治療有良好的反應(yīng),但許多患者在接受內(nèi)分泌治療后1-3年內(nèi),逐步進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌(Androgen-independent prostate cancer, AIPC)。此時(shí)患者多發(fā)生骨骼等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,對(duì)雄激素去勢(shì)治療敏感性下降,目前無(wú)其它有效治療措施,5年生存率僅為29%。研究發(fā)現(xiàn)約70%晚期前列腺癌患者存在骨轉(zhuǎn)移灶,而骨骼等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致前列腺癌預(yù)后不
11、良的重要原因。
PI3K-AKT-mTOR通路調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖,凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。有研究發(fā)現(xiàn)該通路在原發(fā)性前列腺癌中有42%表達(dá)上調(diào),而在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中則高達(dá)100%。抑制該通路可有效抑制前列腺癌的增殖轉(zhuǎn)移。這表明PI3K-AKT-mTOR在前列腺癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,抑制該通路可作為治療前列腺癌的一個(gè)潛在靶目標(biāo)。
中藥黃芩是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的一種成分。現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn),黃芩具有抗
12、炎、抗病毒、抗氧化、抗過(guò)敏、抗腫瘤的功能。黃芩素(Baicalein)是黃芩的一種活性成分,大量研究發(fā)現(xiàn),黃芩素能夠抑制肝細(xì)胞癌、骨肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。上述研究表明黃芩素具有廣泛的抗腫瘤活性。但目前黃芩素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)的影響未見(jiàn)報(bào)道。黃芩素能否通過(guò)PI3K-AKT-mTOR通路抑制雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡尚未明確。因此在本課題第
13、二部分,深入研究了黃芩素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡的影響,并探討PI3K-AKT-mTOR通路的重要作用。
目的:本研究以雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株DU145和PC-3細(xì)胞為模型,觀察了黃芩素對(duì)DU145和PC-3細(xì)胞活力、凋亡、遷移和侵襲的影響。評(píng)估了黃芩素處理后,DU145和PC-3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的變化,并檢測(cè)了黃芩素對(duì)前列腺癌細(xì)胞中caveolin-1,AKT和mTOR表達(dá)的影響。結(jié)果闡明了前列腺癌
14、細(xì)胞中caveolin-1/AKT/mTOR信號(hào)途徑在黃芩素調(diào)節(jié)的前列腺癌生物學(xué)行為中的作用。
方法:運(yùn)用細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同濃度黃芩素作用不同時(shí)間對(duì)DU145和PC-3細(xì)胞增殖的影響,確定黃芩素最佳作用濃度和時(shí)間。將DU145和PC-3分別與20和40μM黃芩素作用48小時(shí),用流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(Flow cytometricapoptosis assays)評(píng)估黃芩素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。分別運(yùn)
15、用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度黃芩素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。
結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)表明,黃芩素能夠顯著抑制DU145和PC-3細(xì)胞的增殖,并且抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明,黃芩素可以抑制前列腺癌細(xì)胞的橫向遷移,且具有濃度依賴性。Transwell試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了黃芩素對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移的抑制,并且表明黃芩素能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲,其抑制作用同樣具有濃度依賴性
16、。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃芩素可以誘導(dǎo)DU145和PC-3細(xì)胞的凋亡,并且具有濃度依賴性。20和40μM黃芩素使DU145和PC-3細(xì)胞凋亡數(shù)分別增加了0.83、1.82倍和0.24、1.13倍。表明與PC-3細(xì)胞相比,DU145對(duì)黃芩素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感。檢測(cè)黃芩素處理后前列腺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),黃芩素可以上調(diào)Bax、PARP蛋白表達(dá),而下調(diào)Bcl-2、survivin。進(jìn)一步探討黃芩素調(diào)節(jié)前列腺癌生物學(xué)行為的分子機(jī)制
17、,發(fā)現(xiàn)黃芩素可下調(diào)兩株細(xì)胞中caveolin-1、p-AKT和p-mTOR的表達(dá),而總AKT和總mTOR表達(dá)不受影響。給予PI3K抑制劑LY294002,可以增強(qiáng)黃芩素促進(jìn)的Bax上調(diào),而使Bcl-2下調(diào)更加明顯;而CCK-8和Transwell試驗(yàn)表明LY294002可以降低DU145和PC-3細(xì)胞的活力和侵襲能力,并能夠增強(qiáng)黃芩素對(duì)DU145和PC-3細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。
結(jié)論:黃芩素通過(guò)caveolin-1/AKT
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