生物節(jié)律紊亂通過AKT-IL-6信號通路對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、近年，隨著人口老齡化和生活水平的提高，我國前列腺癌發(fā)病率逐年升高。骨是前列腺癌主要的轉(zhuǎn)移器官，骨轉(zhuǎn)移灶不僅給病人帶來劇烈疼痛，而且易引起病理性骨折、脊髓壓迫等并發(fā)癥，嚴重者甚至造成癱瘓和運動障礙，嚴重影響患者生活質(zhì)量和生存時間。但目前對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制并不明確，對于骨轉(zhuǎn)移灶治療手段與效果也非常有限。
　　前列腺癌腫瘤本身產(chǎn)生的生物學效應(yīng)、前列腺癌患者的不適癥狀、治療反應(yīng)、以及自身的焦慮狀態(tài)等因素均會導致患者生物節(jié)律的紊亂，

2、例如晝夜節(jié)律紊亂、日常生活規(guī)律紊亂等。有研究證明生物節(jié)律紊亂可以促進乳腺癌和肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移灶的形成，而在此過程中，白細胞介素6(Interleukin-6，IL-6)發(fā)揮著重要作用。通過文獻調(diào)研，目前尚未發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律紊亂對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響及其作用機制的相關(guān)報道。
　　此外，目前骨轉(zhuǎn)移動物模型多采用左心室注射、脛骨注射、尾靜脈注射等方法建立，上述方法不同程度存在轉(zhuǎn)移特異性差、小鼠術(shù)后死亡率高、不符合腫瘤骨轉(zhuǎn)移病理生理學過

3、程等缺點，因此，建立一種操作簡單、轉(zhuǎn)移特異性高，同時又符合腫瘤骨轉(zhuǎn)移病理生理學過程的動物模型對于腫瘤骨轉(zhuǎn)移及抗腫瘤藥物的分子機制研究具有重要的意義。
　　研究目的：
　　本課題擬通過體外實驗，在RM-1細胞培養(yǎng)基中分別加入異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)，模擬生物節(jié)律紊亂后交感神經(jīng)β受體和α受體激活。檢測IL-6基因表達情況，通過正向?qū)嶒灪头聪驅(qū)嶒炋剿髌湫盘?/p>

4、通路。并建立一種特異高效的腫瘤骨轉(zhuǎn)移動物模型，分別使用小鼠前列腺癌RM-1細胞和表達熒光素酶報告基因(luciferase，luc)的小鼠乳腺癌4T1luc細胞驗證其骨轉(zhuǎn)移成瘤效果。最后通過動物實驗，驗證生物節(jié)律紊亂對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響。
　　研究方法：
　　本課題分三部分開展。首先體外培養(yǎng)小鼠前列腺癌RM-1細胞，分別加入ISO和NE，檢測IL-6變化情況、探索其信號通路，然后嘗試建立新的骨轉(zhuǎn)移動物模型，最后通過體內(nèi)實驗

5、加以驗證。
　　1、第一部分：將小鼠前列腺癌細胞RM-1于含10％血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在其對數(shù)生長期使用ISO10μmol/L和NE10μmol/L（終濃度）處理，使用實時熒光定量核酸擴增檢測(Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)方法檢測藥物刺激不同時間后IL-6表達情況。加入相應(yīng)信號通路抑制劑預(yù)處理1小時后，檢測ISO刺激下IL-6表達情況。隨后在蛋白水平驗證

6、ISO和抑制劑作用下，相關(guān)信號通路蛋白表達情況。并通過增殖實驗和遷移實驗，驗證ISO和抑制劑對RM-1細胞增值能力和遷移能力的影響。
　　2、第二部分：建立一種骨轉(zhuǎn)移特異性高、符合腫瘤骨轉(zhuǎn)移病理生理特點、成瘤高效穩(wěn)定的腫瘤骨轉(zhuǎn)移動物模型。將C57BL/6J雄鼠隨機分為兩組，每組15只：BALB/c雌鼠15只，設(shè)一組。將小鼠前列腺癌細胞RM-1和乳腺癌細胞4T1-luc消化、洗滌、計數(shù)后用生理鹽水重懸至2*10^5個/ml，取100

7、μl，經(jīng)股動脈注射C57BL/6J雄鼠和BALB/c雌鼠各15只。另將100μl相同濃度的RM-1細胞懸浮液經(jīng)髂外動脈注射C57雄鼠15只。比較兩種不同注射方式所需時間、小鼠存活率和成瘤率，并通過活體成像觀察腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。
　　3、第三部分：通過體內(nèi)實驗研究生物節(jié)律紊亂對小鼠前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響，并初步探索普萘洛爾和唑來膦酸對骨轉(zhuǎn)移的抑制作用。選取C57/6J雄鼠，隨機分為對照組、普萘洛爾組、應(yīng)激組和應(yīng)激+普萘洛爾組。將應(yīng)激組和

8、應(yīng)激+普萘洛爾組持續(xù)光照一周，按第二部分敘述方法將RM-1細胞經(jīng)股動脈注入小鼠體內(nèi)。術(shù)后，應(yīng)激處理按照晝夜顛倒應(yīng)激飼養(yǎng)3天-正常晝夜節(jié)律飼養(yǎng)3天(光照和黑暗時間均為12h)的方法，建立晝夜顛倒動物模型;對照組和普萘洛爾組在正常晝夜節(jié)律下飼養(yǎng)，21天后將小鼠麻醉后眼眶動脈取血，通過酶聯(lián)免疫吸附檢測(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中IL-6水平。取小鼠注射側(cè)脛骨與股骨，固定、脫鈣后經(jīng)

9、蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，HE)染色，計算骨轉(zhuǎn)移腫瘤占骨髓腔面積比例，比較差異。隨后，取36只小鼠隨機分為對照組、普萘洛爾組、唑來膦酸20ug/ml組、普萘洛爾+唑來膦酸20ug/ml組、唑來膦酸40ug/ml組、普萘洛爾+唑來膦酸40ug/ml組，各只小鼠均經(jīng)股動脈注射RM-1細胞，21天后將小鼠麻醉后處死，取注射側(cè)腿骨，固定、脫鈣后切片并HE染色，比較骨轉(zhuǎn)移腫瘤占骨髓腔面積，探索普萘洛爾和唑來膦酸對骨

10、轉(zhuǎn)移的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、第一部分：通過qPCR檢測，在ISO10μmol/L處理30min后，RM-1細胞中IL-6表達量比對照組升高3-6倍，使用NE處理后，IL-6表達無明顯升高;使用普萘洛爾預(yù)處理1h，再加入ISO10μM作用30min后，IL-6表達量顯著降低;接下來使用β2信號通路抑制劑ICI118551同樣處理后，IL-6表達量明顯降低，而β1信號通路抑制劑阿替洛爾(Atenolol，ATEN)對I

11、L-6表達抑制作用較弱。通過Western blot檢測ISO10uM作用后β2下游信號通路蛋白表達情況，可見只有磷酸化AKT(Phosphorylation AKT，P-AKT)表達升高，其余β2下游信號通路蛋白表達量無明顯變化。使用P-AKT特異性抑制劑GDC0941預(yù)處理細胞后再加入ISO，可見P-AKT表達明顯降低，同時IL-6基因表達量也被明顯抑制。通過劃痕實驗和細胞增殖實驗可見，ISO對RM-1細胞的遷移和增殖能力有促進作用

12、，而普萘洛爾和GDC0941對RM-1細胞的遷移能力和增殖能力有明顯抑制作用。
　　2、第二部分：經(jīng)股動脈注射方法所需的平均止血時間為2.53±1.75min，經(jīng)髂外動脈注射方法所需的平均止血時間為4.70±1.63min(P＜0.05);經(jīng)股動脈注射方法的平均手術(shù)時間為14.67±2.16min，經(jīng)髂外動脈注射方法的平均手術(shù)時間為22.47±3.50min(P＜0.05);術(shù)后21天經(jīng)股動脈和髂外動脈注射組小鼠的生存率分別為93

13、.3％和66.7％(P＜0.05);通過活體成像可見，采用兩種方法的腫瘤骨轉(zhuǎn)移率均為100％。
　　3、第三部分：通過ELISA法檢測小鼠血清發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組IL-6水平較對照組明顯升高(P＜0.01)，應(yīng)激組+普萘洛爾組血清中IL-6水平較應(yīng)激組有明顯降低(P＜0.01)。對小鼠骨切片進行分析，應(yīng)激組骨轉(zhuǎn)移面積明顯高于對照組(P＜0.01)，應(yīng)激組+普萘洛爾組骨轉(zhuǎn)移面積較應(yīng)激組有顯著縮小(P＜0.01)。在骨轉(zhuǎn)移抑制試驗中，普萘洛爾

14、聯(lián)合唑來膦酸對骨轉(zhuǎn)移的抑制作用要優(yōu)于單獨使用普萘洛爾組(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組的抑制效果沒有顯著差異;單獨使用唑來膦酸對骨轉(zhuǎn)移無明顯抑制作用。
　　研究結(jié)論：
　　1、ISO可通過P-AKT通路，刺激RM-1細胞中IL-6基因表達升高，普萘洛爾、ICI118551和GDC0941可明顯抑制這一現(xiàn)象。同時普萘洛爾和GDC0941對RM-1的增殖和遷移能力產(chǎn)生明顯的抑制作用。通過qPCR可發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的延長，普

15、萘洛爾對MMP2表達的抑制效果也逐漸增強。
　　2、經(jīng)股動脈注射方法，腫瘤細胞可特異性地轉(zhuǎn)移到小鼠腿骨。此種方法手術(shù)及止血時間短、小鼠的存活率及腫瘤轉(zhuǎn)移的成功率高，且符合腫瘤骨轉(zhuǎn)移的病理生理過程，可作為建立腫瘤骨轉(zhuǎn)移小鼠模型的新方法。
　　3、生物節(jié)律紊亂可以使小鼠血清中IL-6表達水平升高，同時可促進骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，普萘洛爾可以抑制這一過程。普萘洛爾和唑來膦酸聯(lián)合用藥可以減輕骨轉(zhuǎn)移的程度，單獨使用普萘洛爾亦可抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生