慢性心理應(yīng)激通過β2-AR-AKT-PKA信號通路對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移影響的研究.pdf

1、前列腺癌(prostate，PCa)是常見的男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，在歐美國家的男性惡性腫瘤中，其發(fā)病率位居首位，死亡率位居第二。近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，老年男性平均壽命的增加，環(huán)境污染及人們生活壓力逐漸增大，我國前列腺癌的發(fā)病率也在逐年升高。骨骼是其最易轉(zhuǎn)移的部位之一，有超過80％的患者最終都會有骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，大約30％～50％的患者在初診時即有骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并且骨轉(zhuǎn)移會出現(xiàn)嚴(yán)重的骨痛、病理學(xué)骨折、神經(jīng)壓迫等各種并發(fā)癥，嚴(yán)重降低了患

2、者的生活質(zhì)量。
　　近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式向生物-心理-社會模式的轉(zhuǎn)換，心理因素對疾病的作用越來越得到更多人的重視，尤其對于前列腺癌等惡性腫瘤患者，由于對癌癥的懼怕及高昂的治療費用，在漫長的診療過程中，患者總是被不同程度的精神心理壓力所困擾。一些不良情緒如長期的緊張、焦慮、抑郁等，使患者處于一種長期的慢性心理應(yīng)激狀態(tài)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，慢性心理應(yīng)激通過交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(sympatho-adrenomedullary sys

3、tem,SAMS)及下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hyp othalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)，調(diào)節(jié)體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)分泌，從而促進體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)機體的免疫，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的影響。
　　研究表明，白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)對許多腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌和胃癌等）的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，其對前列腺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移等作用也已被大量研究所證實。然而慢性心

4、理應(yīng)激是如何調(diào)控IL-6的表達(dá)，是通過什么信號通路調(diào)控IL-6的表達(dá)？這些問題目前尚不是十分清楚。
　　目的：
　　體外培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞，分別從基因水平和蛋白水平揭示兒茶酚胺類物質(zhì)（異丙腎上腺素等）調(diào)控IL-6表達(dá)的信號通路;建立一種新穎的、使前列腺癌細(xì)胞特異性向骨骼轉(zhuǎn)移的動物模型;通過束縛、搖晃等方法建立一種慢性心理應(yīng)激動物模型，通過小鼠探索慢性心理應(yīng)激對IL-6的表達(dá)影響，并對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移影響，為前列腺癌的臨床綜合治

5、療提供思路和方法。
　　方法：
　　本研究分為兩部分：(1)體外培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞PC3，將同一培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞均勻接種到六孔板內(nèi)，用異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)和去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)處理不同時間后收取細(xì)胞，提取總RNA，通過實時熒光定量核酸擴增檢(Real-time quantitative PCR，qPCR)IL-6表達(dá)，然后使用不同信號通路抑制劑預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞，隨后檢

6、測其表達(dá)是否發(fā)生變化，從轉(zhuǎn)錄水平揭示兒茶酚胺調(diào)控IL-6表達(dá)的信號通路;Western blot檢測信號通路蛋白表達(dá)，從翻譯水平揭示兒茶酚胺調(diào)控IL-6表達(dá)的信號通路;(2)通過股動脈注射建立骨轉(zhuǎn)移小鼠模型，然后通過束縛、搖晃，濕潤墊料等方法建立慢性心理應(yīng)激小鼠模型。實驗分為四組：A.對照組(control);B.應(yīng)激組(stress);C.腹腔注射異丙腎上腺素組(ISO);D.應(yīng)激加腹腔注射普萘洛爾組(stress+Pro)。股動脈注

7、射前列腺癌細(xì)胞后三周，在活體狀態(tài)下，對小鼠眼眶取血，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測離心后的小鼠血清中IL-6含量，統(tǒng)計分析結(jié)果;隨后處死小鼠，將注射前列腺癌細(xì)胞側(cè)的下肢骨取出，多聚甲醛（4％，中性）固定24h，脫鈣15天，石蠟包埋、切片，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色，統(tǒng)計分析不同

8、組別間的破骨細(xì)胞數(shù)量，蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin,HE)染色，觀察統(tǒng)計不同分組間的腫瘤所占面積大小，所有實驗結(jié)果由統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0比較各組間差異。
　　結(jié)果：
　　1.ISO和NE均能使IL-6表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05），當(dāng)使用Propranolol（非選擇性β-受體阻斷劑）和ICI118551（β2-AR特異性阻滯劑）預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞后，IL-6表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05）

9、，而用阿替洛爾(Atenolol，ATEN，β1-AR阻滯劑)預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞后其表達(dá)未發(fā)生明顯變化(P＞0.05)，WP1066(STAT3抑制劑)和PD184352(ERK抑制劑)預(yù)處理后，IL-6表達(dá)無明顯變化(P＞0.05);而H89(AKT抑制劑)及GDC0941(PKA抑制劑）預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞后，IL-6表達(dá)均明顯下降(P＜0.05);Western blot結(jié)果顯示，異丙腎上腺素使P-AKT抗體蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0

10、.05)，當(dāng)使用非選擇性β受體阻滯劑普萘洛爾、β2受體阻斷劑ICI118551預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞后，其表達(dá)則出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，使用PKA抑制劑GDC0941預(yù)處理前列腺癌細(xì)胞后，其表達(dá)亦明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　2.TRAP染色結(jié)果顯示，與對照組比較，腹腔注射ISO組小鼠下肢骨中破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05），應(yīng)激組與腹腔注射ISO組間的結(jié)果類似，且兩組之間無明顯差異(P＞0.05);與應(yīng)激組比較，而應(yīng)激加

11、腹腔注射普萘洛爾組破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P＜0.05);HE染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，應(yīng)激和腹腔注射ISO組小鼠下肢骨中腫瘤細(xì)胞面積明顯增大(P＜0.05）;而兩組之間無明顯差異;與應(yīng)激組相比，應(yīng)激加腹腔注射普萘洛爾組腫瘤面積明顯減小(P＜0.05);ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，腹腔注射ISO組小鼠血清中IL-6含量明顯增加(P＜0.05），應(yīng)激組結(jié)果與之類似，且兩組間無明顯差異(P＞0.05);與應(yīng)激組比較，應(yīng)激加腹腔注射普萘洛爾

12、組IL-6含量明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.異丙腎上腺素可上調(diào)前列腺癌細(xì)胞IL-6的表達(dá)，通過β2-AR-AKT-PKA信號通路調(diào)控其表達(dá);
　　2.股動脈注射法建立的前列腺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型，轉(zhuǎn)移成功率較高，特異性地轉(zhuǎn)移至小鼠下肢骨，避免了除骨之外的其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移造成的干擾，為我們研究前列腺癌骨轉(zhuǎn)移機制提供了有利條件。
　　3.慢性心理應(yīng)激加速白細(xì)胞介素6等細(xì)胞因子的分泌。
　　4.慢性應(yīng)激