沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)HeLa細(xì)胞自噬及體內(nèi)感染過程的影響.pdf

1、目的：
　　沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv（Salmonella plasmid virulence genes）與細(xì)菌毒力表型密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，S. typhimurium）野生株和突變株為受試菌，通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化條件構(gòu)建熒光素酶標(biāo)記的發(fā)光菌株。構(gòu)建沙門菌感染的細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，研究該基因在體內(nèi)外對(duì)細(xì)胞自噬及感染過程的影響，為后續(xù)深入研究沙門菌致病機(jī)制及探

2、索細(xì)胞自噬分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤沙門菌的感染過程提供有效的工具和手段。
　　方法：
　　一、鼠傷寒沙門菌生物發(fā)光菌株的構(gòu)建
　　為研究影響電轉(zhuǎn)化效率的因素，選用不同感受態(tài)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基、感受態(tài)細(xì)胞濃度、電擊參數(shù)和質(zhì)粒濃度等條件，以小分子質(zhì)粒pDMT-GFP電轉(zhuǎn)化受試菌，通過計(jì)算轉(zhuǎn)化效率確定優(yōu)化的電轉(zhuǎn)條件。在此基礎(chǔ)上用攜帶熒光素酶基因的大分子質(zhì)粒pBEN276電轉(zhuǎn)化spv基因野生株S. typ

3、himuriumχ3306和spv基因突變株S. typhimurium UF110。成功獲得轉(zhuǎn)化子后以阿拉伯糖誘導(dǎo)重組，經(jīng)生物發(fā)光檢測篩選穩(wěn)定發(fā)光菌株，獲得野生株和突變株的發(fā)光菌χ3306lux和UF110lux。連續(xù)傳代12 d，每3 d檢測一定數(shù)量細(xì)菌的生物發(fā)光強(qiáng)度，以確定生物發(fā)光的穩(wěn)定性。梯度稀釋發(fā)光菌菌液，檢測生物發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算菌量和發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系。
　　二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響
　　1

4、.以攜帶spv基因的鼠傷寒沙門菌野生株χ3306lux和突變株UF110lux與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了帶有紅色和綠色熒光蛋白標(biāo)記微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3，LC3）（mRFP-GFP-LC3）的HeLa細(xì)胞體外共培養(yǎng)，制備細(xì)胞感染模型，以未感染的細(xì)胞作為正常對(duì)照組。細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，以100：1的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI

5、）感染細(xì)胞。在細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后向培養(yǎng)基中加入終濃度100μg/ml的阿米卡星（Amikacin，AMK）殺滅胞外菌。AMK作用2 h后更換培養(yǎng)基，使AMK濃度降至10μg/ml以抑制從感染細(xì)胞中釋放至培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長。分別在共培養(yǎng)后1 h、3 h和5 h收集細(xì)胞，用共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察胞內(nèi)LC3-Ⅱ黃色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。
　　2.以野生株χ330

6、6lux和突變株UF110lux感染HeLa細(xì)胞，按上述方法制備細(xì)胞感染模型。分別在感染后1 h、3 h和5 h收集細(xì)胞，用蛋白免疫印跡法（Western blot，WB）檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和p62蛋白的表達(dá)情況，通過檢測胞內(nèi)菌生物發(fā)光強(qiáng)度追蹤細(xì)菌胞內(nèi)繁殖情況，并用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測胞內(nèi)集落形成單位（colony forming unit，CFU）。
　　三、spv基因?qū)w內(nèi)感染過程的影響
　　用野生株

7、χ3306lux和突變株UF110lux腹腔注射感染小鼠，建立體內(nèi)感染模型，以注射等量生理鹽水的小鼠作為正常對(duì)照組。（1）感染后6 h、1 d、2 d、3 d、4 d和5 d記錄小鼠的體重變化和存活情況。（2）為檢測細(xì)菌生物發(fā)光強(qiáng)度追蹤細(xì)菌在不同臟器的定位取小鼠麻醉，用小動(dòng)物活體成像儀觀察兩組細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的繁殖和播散。每組隨機(jī)抽取小鼠處死并分離肝臟、脾臟和盲腸，觀察臟器形態(tài)學(xué)變化并檢測生物發(fā)光強(qiáng)度。（3）隨機(jī)抽樣用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測小

8、鼠肝臟和脾臟的胞內(nèi)CFU，WB檢測肝臟自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和p62的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、生物發(fā)光菌株的構(gòu)建
　　以含NaCl濃度15 g/L的高滲LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌至OD600為0.3，制備濃度為1010cfu/mL的感受態(tài)細(xì)胞，在參數(shù)為2.5 kV,400Ω,50μF條件下，用常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)化的大質(zhì)粒pBEN276轉(zhuǎn)化受試菌后成功獲得轉(zhuǎn)化子。誘導(dǎo)重組后，經(jīng)PCR鑒定及生物發(fā)光檢測，成功構(gòu)建了穩(wěn)定發(fā)光的

9、鼠傷寒沙門菌菌株χ3306lux和UF110lux。
　　二、沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響
　　1. CLSM檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ結(jié)果顯示，細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，野生株χ3306lux感染組細(xì)胞內(nèi) LC3-Ⅱ的黃色熒光點(diǎn)狀聚集數(shù)量明顯低于突變株UF110lux感染組（p<0.05），3 h和5 h時(shí)兩組黃色熒光點(diǎn)狀聚集數(shù)量未見明顯差異（p>0.05）。
　　2. WB檢測結(jié)果顯示，在細(xì)菌和

10、細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，野生株感染組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)低于突變株感染組（p<0.05），3 h和5 h未見明顯差異（p>0.05）。在細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，野生株感染組細(xì)胞自噬底物蛋白 p62表達(dá)高于突變株感染組（p<0.05），3 h和5 h未見明顯差異（p>0.05）。胞內(nèi)菌生物發(fā)光檢測結(jié)果顯示，在細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，兩感染組間胞內(nèi)菌生物發(fā)光強(qiáng)度未見明顯差異（p>0.05），共培養(yǎng)3 h和5 h后

11、，野生株感染組胞內(nèi)菌生物發(fā)光強(qiáng)度高于突變株感染組（3 h，p<0.05；5 h，p<0.01）。平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，在細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，兩感染組間胞內(nèi)活菌數(shù)未見明顯差異（p>0.05），共培養(yǎng)3 h和5 h后，野生株感染組胞內(nèi)活菌數(shù)高于突變株感染組（3 h，p<0.05；5 h，p<0.01）。
　　三、spv基因?qū)w內(nèi)感染過程的影響
　　1.動(dòng)物模型結(jié)果顯示，在感染后1-5 d，野生株感染組和突變株感染組小鼠均有

12、毛發(fā)凌亂，活動(dòng)少，精神狀態(tài)差，腹瀉消瘦等現(xiàn)象，以野生株感染組小鼠為重且存活率更低。對(duì)照組小鼠毛發(fā)有光澤，活動(dòng)多，精神狀態(tài)好，體重基本維持不變。
　　2.小動(dòng)物活體成像結(jié)果顯示，感染后2 d，野生株和突變株感染組體內(nèi)均可檢測到發(fā)光的細(xì)菌，同一時(shí)間點(diǎn)野生株生物發(fā)光強(qiáng)度高于突變株感染組。隨著感染時(shí)間的延長，野生株感染組細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散速度較快，至5 d已播散至全身，而突變株感染組繁殖和擴(kuò)散程度卻較慢。解剖小鼠后觀察肝、脾和盲腸

13、形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)野生株和突變株感染組與對(duì)照組相比，肝臟、脾臟明顯增大，盲腸縮短并出現(xiàn)水泡樣病變；野生株感染組與突變株感染組相比，肝臟和脾臟腫大更嚴(yán)重，肝臟表面出現(xiàn)點(diǎn)狀病灶，盲腸縮短更多且水泡樣病變更重，表面充血更重。生物發(fā)光檢測結(jié)果顯示，野生株感染組各臟器內(nèi)細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度高于突變株感染組。
　　3.肝臟和脾臟胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，野生株感染組肝臟和脾臟胞內(nèi)活菌數(shù)均高于突變株感染組（p<0.05）。WB檢測結(jié)果顯示，在感染后6 h、1

14、 d和2 d，野生株感染組小鼠肝臟和脾臟中 Beclin-1蛋白的表達(dá)明顯高于突變株感染組（p<0.05），p62蛋白的表達(dá)明顯低于突變株感染組（p<0.05），3 d至5 d兩組未見明顯差異（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.以優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化條件成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌穩(wěn)定生物發(fā)光菌株，為今后在體內(nèi)外實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)追蹤沙門菌感染提供了有效工具。
　　2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv能影響HeLa細(xì)胞自噬水平，以利于宿主菌在細(xì)胞