傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pR-,ST98- spv毒力基因與樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫反應(yīng)中關(guān)系的研究.pdf

1、目的：研究傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pRST98spv毒力基因與樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的關(guān)系，為進(jìn)一步明確spv在沙門(mén)菌致病中的作用機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：由于傷寒沙門(mén)菌是一種嚴(yán)格只對(duì)人類(lèi)致病的病原體，沒(méi)有一個(gè)合適的動(dòng)物模型和有效的遺傳學(xué)工具，我們利用與其有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門(mén)菌的研究途徑和方法來(lái)研究pRsT98spv毒力基因的作用。將pRST98導(dǎo)入有成熟動(dòng)物模型和遺傳背景明確的鼠傷寒沙門(mén)菌低毒株P(guān)IA，形成接合子pRST98

2、/RIA，并用攜帶一分子量為100Kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)毒株SR-11作陽(yáng)性對(duì)照，RIA低毒株作陰性對(duì)照，進(jìn)行體內(nèi)外對(duì)比研究。 1.將C57BL/6(B6)純種小鼠隨機(jī)分為三組，分別經(jīng)腹腔注射三種鼠傷寒沙門(mén)菌SR-11、pRST98/RIA、RIA，另設(shè)PBS對(duì)照組。在不同時(shí)間段處死小鼠后取脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC的數(shù)量及其表面的協(xié)同刺激分子CD80和CD86，比較細(xì)菌刺激DC成熟的能力。 2.分

3、別用三種鼠傷寒沙門(mén)菌經(jīng)腹腔注射小鼠，第五天處死后取脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠分選樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，此為體內(nèi)致敏DC(分別稱(chēng)為DC-SR-11、DC-pRST98／RIA、DC-RIA)；另制備未接觸上述細(xì)菌抗原的小鼠脾臟DC，作為未致敏DC。制備三種細(xì)菌的熱滅活抗原，分別與相應(yīng)細(xì)菌致敏的DC、未致敏DC在體外共培養(yǎng)，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的IFN-γ和IL-10，評(píng)價(jià)spv活化DC分泌細(xì)胞因子的能力。 3.混合淋巴細(xì)胞

4、反應(yīng)：將體內(nèi)致敏DC、未致敏DC分別與分離自未接觸受試菌的小鼠脾臟的初始型CD4+和CD8+T細(xì)胞(na[i]veT細(xì)胞)共培養(yǎng)，3H-TdR摻入法檢測(cè)DC將抗原遞呈給初始型T細(xì)胞并使之活化增殖的能力。 結(jié)果：1.經(jīng)腹腔分別注射三種鼠傷寒沙門(mén)菌后，小鼠脾臟中DC的數(shù)量和細(xì)胞表面分子CD80、CD86的表達(dá)在第2、5、7天逐漸升高，其程度按KIA、pRsT98／RIA、SR-11依次遞增。 2.體內(nèi)致敏DC與相應(yīng)滅活抗原共

5、培養(yǎng)前后分泌的IFN-γ均比未致敏DC高，而其分泌的IL-10與未致敏DC無(wú)差異。兩種細(xì)胞因子在三種致敏DC組間無(wú)顯著性差異。 3.三種體內(nèi)致敏DC均能刺激na[i]veCD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，且T細(xì)胞的增殖能力按DC-RIA、DC-pRST98／RIA、DC-SR-11依次遞增。 結(jié)論：對(duì)傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒pRST98spv毒力基因與樹(shù)突狀細(xì)胞在免疫反應(yīng)中關(guān)系的研究顯示1.含有spv的pRST98/RIA接合子感染