沙門菌質粒毒力基因spvB突變株的構建及其對上皮細胞自噬的影響.pdf

1、目的：
　　 構建沙門菌質粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene B，spvB)突變株，通過上皮細胞感染模型，研究該基因對細胞自噬的影響，為探討沙門菌質粒毒力基因spvB致病機制及減毒活疫苗的制備提供理論和實驗依據，并為后續(xù)利用小鼠感染模型進一步研究該基因的功能提供工具和手段。
　　 方法：
　　 一.沙門菌質粒毒力基因spvB突變株的構建
　　 1.根據GeneB

2、ank序列數據庫中沙門菌質粒毒力基因spvB序列，用PrimerPremier5.0設計PCR特異性引物，以鼠傷寒沙門菌標準株SR-11基因組為模板，擴增獲得spvB基因缺陷性核苷酸片段后連接至自殺質粒PGMB151。將改建的自殺載體導入含有spvB基因的鼠傷寒沙門菌SR-11野生株中進行同源重組，用PCR方法挑選穩(wěn)定傳代的突變株并進行基因測序鑒定。
　　 2.根據spvB基因序列設計引物，以鼠傷寒沙門菌標準株SR-11基因組為

3、模板，通過PCR擴增獲得含spvB基因編碼區(qū)域的全長DNA，并與表達載體pBAD/gⅢ定向連接，轉化至大腸桿菌TOP10中篩選陽性克隆質粒，經序列分析后將陽性重組載體電轉化至spvB基因突變株，作為spvB基因突變回補株，用PCR、核酸測序及蛋白免疫印跡(Western blot，WB)鑒定。
　　 二，沙門菌質粒毒力基因spvB對上皮細胞自噬的影響
　　 1.以攜帶spvB的鼠傷寒沙門菌標準株SR-11，敲除spvB的

4、鼠傷寒沙門菌突變株(SR-11-AspvB)及其回補株(SR-11-c-spvB)，與穩(wěn)定轉染了帶有紅色和綠色熒光蛋白標記微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)(mRFP-GFP-LC3)的HeLa細胞體外共培養(yǎng)，制作細胞感染模型。將對數生長期細菌按感染復數(multiplicity of infection，MOI)100:1感染細胞，在細菌和細胞共培養(yǎng)

5、1h后吸除上清，此時定為“0”點。隨后加入含100μg/ml阿米卡星(Amikacin，AMK)培養(yǎng)基作用2h以殺滅胞外菌，最后將AMK濃度降至10μg/ml以抑制從感染細胞中釋放至培養(yǎng)基中的細菌生長。分別在共培養(yǎng)后1h、3h和5h收集細胞，用共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察胞內LC3-Ⅱ黃色點狀結構。
　　 2.以攜帶spvB的鼠傷寒沙門菌標準株SR-1

6、1，敲除spvB的鼠傷寒沙門菌突變株(SR-11-AspvB)及其回補株(SR-11-c-spvB)與HeLa細胞體外共培養(yǎng)，制作細胞感染模型。以對數生長期細菌按感染復數(multiplicity of infection，MOI)100：1感染細胞，在細菌和細胞共培養(yǎng)1 h后吸除上清，此時定為“0”點，隨后加入含100μ9/ml阿米卡星(Amikacin，AMK)培養(yǎng)基作用2h以殺滅胞外菌，最后將AMK濃度降至10μg/ml以抑制從感

7、染細胞中釋放至培養(yǎng)基中的細菌生長。分別在共培養(yǎng)后1h、3h和5h收集細胞，用蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測自噬相關蛋白Beclin-1和p62蛋白的表達情況，并用平板菌落計數法檢測胞內集落形成單位(colony forming unit，CFU)。
　　 結果：
　　 一.沙門菌質粒毒力基因spvB突變株的構建
　　 1.經PCR和基因測序證實，成功獲得了spvB基因缺陷的鼠傷寒沙門菌突變株

8、SR-11-AspvB。
　　 2.經PCR、基因測序和WB證實，成功獲得了spvB基因突變回補株SR-11-c-spvB。
　　 二.沙門菌質粒毒力基因spvB對上皮細胞自噬的影響
　　 1.CLSM檢測自噬相關蛋白LC3-Ⅱ結果顯示，細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，SR-11和回補株SR-11-c-spvB感染組細胞內LC3-Ⅱ的黃色熒光點狀聚集數明顯低于SR-11-△spvB感染組(P<0.05)；3h和5h時三組

9、黃色熒光點狀聚集數未見明顯差異(P>0.05)。在細菌和細胞共培養(yǎng)的各時間點，SR-11和回補株SR-11-c-spvB感染組細胞內LC3-Ⅱ的黃色熒光點狀聚集數無明顯差異(P>0.05)。
　　 2.WB檢測結果顯示，在細菌和細胞共培養(yǎng)1h后，SR-11和SR-11-c-spvB感染組細胞自噬相關蛋白Beclin-1表達低于SR-11-△spvB感染組(P<0.05)，3h和5h無明顯變化(P>0.05)。在細菌和細胞共培養(yǎng)1

10、h后，SR-11和SR-11-c-spvB感染組細胞自噬相關蛋白p62表達高于SR-11-△spvB感染組(P<0.05)，3h和5h無明顯差異(P>0.05)。CFU結果顯示，在細菌和細胞共培養(yǎng)1 h后，各感染組間胞內活菌數無明顯差異(P>0.05)；共培養(yǎng)3h和5h后，SR-11和SR-11-c-spvB感染組胞內活菌數高于SR-11-△spvB感染組(3h，P<0.05；5 h，P<0.01)；在細菌和細胞共培養(yǎng)的各時間點，SR-

11、11和回補株SR-11-c-spvB感染組胞內活菌數無明顯差異(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.運用自殺質粒載體成功構建了鼠傷寒沙門菌質粒毒力基因spvB突變株SR-11-△spvB；運用原核表達載體pBAD/gⅢ成功構建了回補株SR-11-c-spvB，為進一步研究該質?；虻墓δ芎蜏p毒疫苗的制備提供了工具和手段。
　　 2.沙門菌質粒毒力基因spvB對上皮細胞的自噬有抑制作用。在細菌和細胞共培養(yǎng)1h

12、后，鼠傷寒沙門菌標準株SR-11和回補株SR-11-c-spvB感染組細胞內自噬相關蛋白LC3-Ⅱ聚集量和自噬相關蛋白Beclin-1表達量均低于突變株SR-11-△spvB感染組；自噬相關蛋白p62表達量則高于突變株SR-11-△spvB感染組。在細菌和細胞共培養(yǎng)3h和5h后，SR-11和回補株SR-11-c-spvB感染組胞內活菌數明顯高于突變株SR-11-AspvB感染組。以上結果說明，毒力基因spvB對發(fā)生在細菌細胞共作用早期的