NF-κB在鼠疫菌毒力蛋白YopE致病過(guò)程中作用機(jī)制的研究.pdf

1、YopE是鼠疫菌六種分泌蛋白之一，在鼠疫的致病過(guò)程中起重要作用。在宿主細(xì)胞內(nèi)，YopE作為GTP水解酶，通過(guò)其144位―精氨酸手指‖結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜藕聯(lián)蛋白R(shí)hoGTP酶相互作用使該酶由活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為非活性狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白actin的降解，使感染細(xì)胞受損。如果將其144位的精氨酸突變?yōu)楸彼幔╕opE(R144A)）則YopE不具有GAP活性。
　　核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（Nuclearfactor-κB）是響應(yīng)環(huán)境變化的一個(gè)至關(guān)

2、重要的轉(zhuǎn)錄因子，是進(jìn)化上高度保守的信號(hào)模塊，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在許多生物過(guò)程，如機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化與凋亡及其他應(yīng)激反應(yīng)等，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母雙雜交篩庫(kù)及陣列篩選發(fā)現(xiàn)YopE與p65存在相互作用，提示YopE與p65的相互作用可能在鼠疫菌的感染過(guò)程中起重要的作用。本研究通過(guò)免疫共沉淀，GST-PullDown實(shí)驗(yàn)證明YopE與p65確實(shí)存在相互作用。GST-PullDown實(shí)驗(yàn)確

3、定YopE與p65的相互作用結(jié)構(gòu)域?yàn)閅opE(1-49aa、88-99aa)和p65(201-312aa)，其中YopE的88-99肽段在與p65的相互作用中起重要作用。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)染早期YopE以不依賴GAP活性方式顯著激活NF-κB通路。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)YopE能促進(jìn)p65入核。表達(dá)YopE上調(diào)NF-κB下游靶基因，其中明顯上調(diào)NF-κB下游的抗凋亡和炎癥反應(yīng)基因。抑制NF-κB通路增加YopE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。機(jī)制上，我

4、們發(fā)現(xiàn)YopE能明顯促進(jìn)p65與IκBα的解離。本文同時(shí)還構(gòu)建了YopE/YopE(R144A)的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并用該系統(tǒng)驗(yàn)證了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　此外，本文還采用可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)研究了YopE/YopE(R144A)對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。發(fā)現(xiàn)YopE明顯抑制Rosup所引起的細(xì)胞ROS產(chǎn)生、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)p21蛋白表達(dá)。
　　綜上，本研究發(fā)現(xiàn)YopE通過(guò)與p65的相互作用促進(jìn)NF-κB活化，并提高細(xì)胞的存活能