NF-κB通路在神經(jīng)母細胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機制.pdf

1、目的：NF-κB通路是介導(dǎo)炎癥和腫瘤的重要通路，通過干預(yù)NF-κ B通路可以對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移進行臨床干預(yù)。本課題以自主建立的有骨髓轉(zhuǎn)移的神經(jīng)母細胞瘤細胞系(QDDQ-NM1)為對象，初步探討NF-κB通路在神經(jīng)母細胞瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用及其機制，進一步尋找NF-κB通路中的作用靶點，利用靶點開發(fā)特異性結(jié)合藥物，治療神經(jīng)母細胞瘤，為神經(jīng)母細胞瘤的治療提供新途徑。
　　 方法：應(yīng)用自主建立的國人神經(jīng)母細胞瘤細胞系QDDQ-NM，利用N

2、F-κB通路特異性激活劑、抑制劑對細胞系進行干預(yù)。NF-κB通路特異性激活劑腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)對細胞系進行干預(yù)（該組細胞為Ⅰ組），使NF-κB通路達到理論上的最大程度激活;空白對照組（Ⅱ組），利用同等量的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，和不同干預(yù)的細胞組進行比較。NF-κB通路特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(Pyrrolidinedithiocarbamic acid, ammonium sa

3、lt，PDTC)對細胞系進行干預(yù)（該組細胞為Ⅲ組），使NF-κB通路達到理論上的最大程度抑制。各組細胞均置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。應(yīng)用半定量RT-PCR檢測不同干預(yù)措施細胞P65mRNA、CXCR4mRNA的表達。利用凝膠圖像掃描儀條帶灰度分析各組細胞P65mRNA、CXCR4mRNA的相對表達，從而分析P65mRNA、CXCR4mRNA在各組細胞中的表達變化，證實他們之間的聯(lián)系;應(yīng)用Western-blot蛋白印跡法檢

4、測不同干預(yù)措施細胞P65蛋白、CXCR4蛋白的相對表達，應(yīng)用Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，得出各組P65蛋白、CXCR4蛋白相對表達，從而分析P65蛋白、CXCR4蛋白在各組細胞中的表達變化，證實他們之間的聯(lián)系。Transwell小室是檢測腫瘤細胞體外轉(zhuǎn)移侵襲能力的經(jīng)典方法，利用Transwell小室檢測不同干預(yù)措施細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。在相同培養(yǎng)條件下通過觀察各組細胞穿過ECM膠的細胞數(shù)來表示瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，穿過

5、ECM膠的細胞數(shù)目多，表示瘤細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力強;反之，則侵襲轉(zhuǎn)移能力弱。進而分析各組細胞干預(yù)的效果。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果示Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，其P65 mRNA相對含量分別為0.7211±0.2233;0.6002±0.1822和0.5553±0.0904即在各組細胞中都有P65 mRNA表達，且Ⅰ組高于Ⅱ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CXCR4 mRNA相對表達含量分別為0.4128±0

6、.0176;0.3045±0.1910和0.1829±0.0091即在各組細胞中都有CXCR4mRNA表達，且Ⅰ組高于Ⅱ組，Ⅱ組高于Ⅲ組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果表明，Ⅰ組細胞在NF-κB通路最大程度激活時其NF-κ B蛋白P65的mRNA高表達，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4mRNA也處于高表達狀態(tài);Ⅲ組細胞是在NF-κB通路抑制狀態(tài)下，其NF-κB蛋白P65的mRNA表達明顯較少，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4m

7、RNA也處于低表達狀態(tài)。與空白對照組細胞比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。Western結(jié)果示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組蛋白相對灰度值分別為:P65蛋白，0.9026±0.0375;0.8340±0.0379;0.8007±0.0793; CXCR4蛋白，0.9472±0.0193;0.9091±0.0216;0.6025±0.0384。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Western結(jié)果表明，Ⅰ組細胞在NF-κB通路最大程度激活時其NF-κB蛋白P65

8、高表達，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4也處于高表達狀態(tài);Ⅲ組細胞是在NF-κ B通路抑制狀態(tài)下，其NF-κB蛋白P65表達明顯較少，其下游調(diào)節(jié)蛋白CXCR4也處于低表達狀態(tài)。與空白對照組細胞比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。Transwell小室檢測各組細胞侵襲力實驗顯示Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組細胞穿過ECM基質(zhì)的細胞數(shù)分別為:55.8000±2.7749;46.6000±5.9414;30.2000±7.4967。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Tran

9、swell小室實驗結(jié)果表明，Ⅰ組細胞在NF-κB通路最大程度激活時，細胞穿過ECM膠的數(shù)目最多;Ⅲ組細胞是在NF-κB通路抑制狀態(tài)下，細胞穿過ECM膠的數(shù)目最少。且與空白對照組細胞比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。表明NF-κB通路能促進神經(jīng)母細胞瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)論：神經(jīng)母細胞瘤細胞系(QDDQ-NM1)細胞在NF-κ B通路不同狀態(tài)下其P65mRNA的表達與其下游基因CXCR4mRNA的表達呈正相關(guān)。神經(jīng)母細胞瘤細胞系(QDDQ