Thymosin β10、Thymosin β15在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用.pdf

1、目的： 本研究探討Tβ10和Tβ15在肺癌中的表達(dá)，分析它們與各臨床病理因素之間的關(guān)系，揭示Tβ10和Tβ15在肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 1、69例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本均來(lái)自1980年到2000年在中國(guó)遼寧省鞍山腫瘤醫(yī)院實(shí)行手術(shù)的病人，患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法檢測(cè)

2、組織中Tβ10、VEGF、VEGF-C蛋白表達(dá)情況，微血管密度和淋巴管密度。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 分別用含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)PG-LH7人肺巨細(xì)胞癌PG的低轉(zhuǎn)移亞系、PG-BE1人肺巨細(xì)胞癌PG的高轉(zhuǎn)移亞系、人肺腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)549。 細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)染色：培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛室溫固定15min，0.2％TritonX-1

3、00處理，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法(S-P法)觀察Tβ10蛋白表達(dá)情況。 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：用含TβlOcDNA全長(zhǎng)序列質(zhì)粒pcDNA3.0-Tβ10)及pcDNA3.0載體構(gòu)建Tβ10cDNA反義重組質(zhì)粒pcDNA3.0-as-Tβ10。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tβ10高表達(dá)的人肺巨細(xì)胞癌PG細(xì)胞系的高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞亞系BEI細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，含400μg/ml G

4、418的RPMI1640篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染的BE1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.0的細(xì)胞(稱為BE1-EV)作為對(duì)照。 RT-PCR方法用來(lái)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞系中Tβ10 mRNA表達(dá)水平和BE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Tβ4 mRNA和Tβ10mRNA變化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用TRIZOL提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增Tβ10、Tβ4，以β-actin為內(nèi)參。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳后成像分析。 免疫熒光：觀察轉(zhuǎn)染

5、前后Tβ4、Tβ10蛋白以及F-actin變化。培養(yǎng)細(xì)胞用4％ 多聚甲醛室溫固定15min。Triton X-100處理，血清封閉后分別滴加Tβ10，Tβ4一抗，4℃孵育過(guò)夜。避光加FITC標(biāo)記二抗和羅丹明-鬼筆環(huán)肽，Hoechst 33342復(fù)染細(xì)胞核后，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。 Western blot：收集細(xì)胞提取總蛋白。采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)印，一抗和各自

6、對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗孵育后DAB顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定。以β-actin為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算VEGF、VEGF-C、ERK1/2和pERK的相對(duì)表達(dá)量。 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO，490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2、76例原發(fā)

7、性非小細(xì)胞肺癌癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本均來(lái)自1980年到2000年在中國(guó)遼寧省鞍山腫瘤醫(yī)院實(shí)行手術(shù)的病人，患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，經(jīng)脫蠟，脫苯，水化后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶免疫組化法檢測(cè)組織中TD15蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色，光鏡下每張切片在診斷確實(shí)的肺癌組織中隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)≤50％為

8、Tp15低表達(dá)，>50％為T(mén)p15高表達(dá)。 細(xì)胞爬片免疫組織化學(xué)染色：培養(yǎng)細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛室溫固定15min，0.2％TritonX-100處理，采用鏈霉素抗生物素蛋白．過(guò)氧化物酶免疫組化法(S-P法)觀察Tβ15蛋白表達(dá)情況。 用含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下分別培養(yǎng)PG-LH7人肺巨細(xì)胞癌PG的低轉(zhuǎn)移亞系、PG-BEI人肺巨細(xì)胞癌PG的高轉(zhuǎn)移亞系。 細(xì)

9、胞轉(zhuǎn)染：pEGFP-C1-Tβ15和pEGFP-C1質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tβ15低表達(dá)的人肺巨細(xì)胞癌PG細(xì)胞系的低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞亞系LH7細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，含400μg/ml G418的RPMI1640篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以未轉(zhuǎn)染的LH7細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1的細(xì)胞作為對(duì)照。 RT-PCR方法用來(lái)檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞系中Tβ15 mRNA表達(dá)水平和LH7細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Tβ1

10、5 mRNA變化。步驟同Tβ10實(shí)驗(yàn)。 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)：細(xì)胞遷移能力檢測(cè)用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，上室中加入2.5×104個(gè)細(xì)胞，下室加入含10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉上表面的細(xì)胞，蘇木素染色。取下聚碳酸酯微孔膜，置載玻片上鏡下觀察。 3、數(shù)據(jù)分析：使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、Tβ10、VEGF、VEGF-C在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系：69例肺癌細(xì)胞中均有Tβ10表達(dá)，表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從20％-90％，其中50例為高表達(dá)，低表達(dá)者為19例。而癌旁正常組織中的肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞為陰性表達(dá)。69例組織中VEGF、VEGF-C的陽(yáng)性率為68.1％和52.2％，表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。Tβ10的高表達(dá)與VEGF、VEGF-C的表達(dá)呈正相關(guān)。Tβ

12、10的表達(dá)水平與肺癌的分期呈正相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與血行轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與肺癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)。 2、LH7、BEI和A549細(xì)胞均有Tβ10 mRNA和蛋白表達(dá)，但低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系LH7中的Tβ10 mRNA表達(dá)明顯低于高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系Bel和A549；Tβ10蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，PG-LH7細(xì)胞呈淺棕黃色，為低表達(dá)，PG-Bel細(xì)胞和A549細(xì)胞均呈深棕黃色，為高表達(dá)。Tβ10高表達(dá)肺癌細(xì)胞系Bel細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Tβ10反義

13、cDNA重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-as-Tβ10后，經(jīng)過(guò)篩選得到Tβ10表達(dá)受到明顯抑制的細(xì)胞BEI-as-Tβ10，其mRNA相對(duì)表達(dá)量與BEI細(xì)胞相比明顯減少。Tβ10表達(dá)降低的BEI-as-Tβ10細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)平行排列聚合的F-actim轉(zhuǎn)染了空載體的BEI細(xì)胞以及未做處理的BEE細(xì)胞胞質(zhì)中看到彌漫散在的熒光信號(hào)，分布雜亂而模糊，難以見(jiàn)到清晰的微絲結(jié)構(gòu)。BEI-as-Tβ10細(xì)胞VEGF、VEGF-C和pERK表達(dá)明顯下調(diào)。

14、 3、MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，BEI-as-Tβ10細(xì)胞增殖能力明顯低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染反義Tβ10細(xì)胞的細(xì)胞穿透數(shù)目與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中Bel-as-Tβ10細(xì)胞穿透數(shù)目與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、76例肺癌組織中均有Tβ15表達(dá)，表達(dá)主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從20％-90％，其

15、中Tβ15蛋白高表達(dá)為51例(67.1％)，低表達(dá)者為25例(32.9％)。Tβ15在癌旁正常組織中的肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞為陰性表達(dá)。Tβ15高表達(dá)與肺癌的分期(P=0.018)、不良分化(P=0.013)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)正相關(guān)。 5、LH7和BE1細(xì)胞均有Tβ15 mRNA和蛋白表達(dá)，低轉(zhuǎn)移亞系LH7中的Tβ15mRNA表達(dá)明顯低于高轉(zhuǎn)移亞系BE1(P<0.01)；Tβ15蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，低轉(zhuǎn)移亞

16、系PG-LH7細(xì)胞呈淺棕黃色，低表達(dá)；高轉(zhuǎn)移亞系PG-BE1細(xì)胞呈深棕黃色，為高表達(dá)。Tβ15低表達(dá)肺癌細(xì)胞系LH7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-Tβ15后Tβ15mRNA含量顯著增加(P<0.01，P<0.01)。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中pEGFP-C1-Tβ15轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿透數(shù)目分別為：96.33± 6.94和98 ±10.58，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(46 ±8.89)和空白對(duì)照組(37 ±8.19)相比明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P

17、=0.044，P=0.002，P=0.016)。 結(jié)論： 1、Tβ10高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移，不良分化正相關(guān)，與VEGF、VEGF-C的表達(dá)正相關(guān)，Tβ10高表達(dá)組腫瘤中的MVD和LVD均明顯高于低表達(dá)組，VEGF、VEGF-C的表達(dá)分別與MVD和LVD呈正相關(guān)。 2、轉(zhuǎn)染反義Tβ10 cDNA重組表達(dá)質(zhì)粒，有效抑制BE1肺癌細(xì)胞的Tβ10表達(dá)水平后，細(xì)胞中出現(xiàn)F-actin，細(xì)胞增殖、