短鏈脂肪酸作用下傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、傷寒沙門(mén)菌屬胞內(nèi)寄生菌，可引起傷寒等嚴(yán)重疾病，它在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活、增殖的能力與其致病性密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞是人體主要的吞噬細(xì)胞，它在許多病原體的清除和破壞中起重要作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)菌感染后可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞異常凋亡，從而逃避機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的識(shí)別。但傷寒沙門(mén)菌引起細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制及生存環(huán)境對(duì)傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響還有待于進(jìn)一步研究。其中就包括傷寒沙門(mén)菌在人體腸道內(nèi)所遭遇的短鏈脂肪酸（short chain fatty acid

2、 SCFA）環(huán)境。本課題擬用醋酸鈉刺激傷寒沙門(mén)菌的生長(zhǎng)以模擬體內(nèi)的SCFA條件，以人白血病細(xì)胞系 THP-1細(xì)胞經(jīng)佛波醇酯(PMA)分化的巨噬細(xì)胞為模型，探討短鏈脂肪酸作用下傷寒沙門(mén)菌對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，從而深入研究傷寒沙門(mén)菌的致病機(jī)制。同時(shí)，分析短鏈脂肪酸作用下傷寒沙門(mén)菌外膜蛋白的表達(dá)，與普通培養(yǎng)條件下傷寒沙門(mén)菌外膜蛋白進(jìn)行比較，觀(guān)察其差別。
　　實(shí)驗(yàn)分三組：普通傷寒沙門(mén)菌組；SCFA作用傷寒沙門(mén)菌組；同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，各組

3、細(xì)菌按20：1與PMA分化的THP-1細(xì)胞建立感染模型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。分別加入caspase3，caspase8，caspase9抑制劑及TNF-α抗體，觀(guān)察其對(duì)細(xì)菌感染后細(xì)胞凋亡的影響。比色法檢測(cè)caspase3，caspase8，caspase9含量，硝酸還原酶法和 ELISA法分別檢測(cè)培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度變化。用普通LB液體培養(yǎng)基及含6％100 mmol/l醋酸鈉的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)傷寒

4、沙門(mén)菌，超聲破碎法提取傷寒沙門(mén)菌外膜蛋白， SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色，在復(fù)日FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置下成像及分析。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組巨噬細(xì)胞于2，4，8，12，24h的凋亡率分別為（0.76±0.15）％；（1.69±0.25）％；（3.29±0.53）％；（5.22±0.49）％；（7.66±0.64）％，傷寒沙門(mén)菌原菌組感染巨噬細(xì)胞后2，4，8，12，24h的細(xì)胞凋亡率分別為（4.07±0.8

5、0）％；（7.14±0.89）％；（12.15±1.44）％；（22.17±2.90）％；（40.54±2.54）％， SCFA作用傷寒沙門(mén)菌組感染巨噬細(xì)胞后相應(yīng)時(shí)段細(xì)胞凋亡率分別為（7.99±0.84）％；（12.70±1.13）％；（20.87±1.79）％；（33.94±2.33）％；（63.84±5.97）％。結(jié)果顯示兩組細(xì)菌感染組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，且凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)（P<0.01）,SCFA作用組細(xì)胞凋亡率各時(shí)段均

6、高于傷寒沙門(mén)菌原菌組（P<0.01）。說(shuō)明傷寒沙門(mén)菌可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，SCFA作用下，傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)。
　　caspase3/8/9抑制劑作用細(xì)胞后加入細(xì)菌感染8 h，Annexin V-FITC染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase3，caspase8抑制劑均能不同程度的減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生（P<0.01），caspase9抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡結(jié)果無(wú)明顯影響。用anti-TNF-α阻斷TNF-

7、α后加入兩組傷寒沙門(mén)菌感染8 h， Annexin V-FITC染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)菌組及SCFA作用傷寒沙門(mén)菌組凋亡率均明顯降低（P<0.01），說(shuō)明 caspase3，caspase8，TNF-α在兩組傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡機(jī)制中均起一定作用，而caspase9在其中無(wú)明顯作用。
　　傷寒沙門(mén)菌原菌及 SCFA作用菌感染巨噬細(xì)胞8h，比色法檢測(cè) caspase3， caspase8，caspase

8、9含量，兩組細(xì)菌感染組 caspase3，caspase8含量均高于對(duì)照組（P<0.01），caspase9含量與對(duì)照組比較無(wú)明顯差別。SCFA作用組caspase3，caspase8兩者含量均高于傷寒沙門(mén)菌原菌組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了 caspase3，caspase8在傷寒沙門(mén)菌原菌及SCFA作用菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中均起一定作用，而caspase9在其中無(wú)明顯作用。
　　傷寒沙門(mén)菌原菌及 SCFA作用菌感染巨噬細(xì)胞8h

9、， ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中TNF-α濃度,結(jié)果顯示傷寒沙門(mén)菌原菌組與SCFA作用組TNF-α濃度均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01），而且SCFA作用組TNF-α高于原菌組。證實(shí)TNF-α在傷寒沙門(mén)菌原菌及SCFA作用菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中均起一定作用。
　　傷寒沙門(mén)菌原菌及SCFA作用菌感染巨噬細(xì)胞8h，硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量，結(jié)果顯示傷寒沙門(mén)菌 SCFA作用組與原菌組 NO濃度均較對(duì)照組明顯升高（P<0.01），且SCFA作用

10、組NO濃度高于原菌組。
　　超聲破碎法提取傷寒沙門(mén)菌原菌及SCFA作用菌外膜蛋白，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán) R250染色，在復(fù)日 FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置下成像及分析可見(jiàn)55KD處SCFA作用菌外膜蛋白表達(dá)高于傷寒沙門(mén)菌原菌，這點(diǎn)與文獻(xiàn)一致。
　　本課題主要對(duì)短鏈脂肪酸作用下傷寒沙門(mén)菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程及其機(jī)制進(jìn)行了探討，并觀(guān)察短鏈脂肪酸作用下傷寒沙門(mén)菌外膜蛋白表達(dá)的變化。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明：短鏈脂肪酸作用下傷