脂筏及其受體在反式脂肪酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用.pdf

1、心血管疾病是在全世界死亡率和發(fā)病率最高的一個(gè)疾病之一。在我國(guó),肥胖和高血壓人口達(dá)2億6千萬(wàn),每年有300萬(wàn)人死于心腦血管疾病,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化。我國(guó)居民攝食油脂較高,遠(yuǎn)超過(guò)了營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的水平。氫化油做為食品加工中常用的油脂,其中反式脂肪酸的含量較高。研究表明,高TFAs攝入除了通過(guò)升高血清 LDL和 TG,引起血管內(nèi)皮損傷外,還可提高可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(SICAM-1)、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1(SVCAM-1)和E-選擇素

2、(E-selectin)的表達(dá)。雖然有很多研究都報(bào)道了TFAs與心血管疾病有關(guān)系,但TFAs對(duì)血管的影響機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)廣泛存在于中國(guó)日常膳食中的反油酸(9t18:1)和反亞油酸(9t12t18:2)能通過(guò) Caspase途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)膜炎性因子釋放。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)這兩種TFAs誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)程度具有顯著差異。近年來(lái)的研究表明,脂筏內(nèi)富含脂類和一些與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的組分,這可能就為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的有

3、效進(jìn)行和各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的“cross talk”提供平臺(tái)。已有文章報(bào)道,多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等可以改變脂筏結(jié)構(gòu),DHA還可改變脂筏脂肪環(huán)境調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素2受體信號(hào)通路。因此猜測(cè)TFAs對(duì)細(xì)胞的影響可能與脂筏結(jié)構(gòu)有關(guān),一方面可能通過(guò)改變脂筏脂肪酸和磷脂組成而影響細(xì)胞,一方面可能通過(guò)刺激脂筏上受體而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究將對(duì)比用脂筏破壞劑破壞細(xì)胞膜脂筏與否,TFAs對(duì)細(xì)胞信號(hào)的影響,探討脂筏及其受

4、體在 TFAs引起細(xì)胞凋亡中的重要作用,為我國(guó)心血管疾病的病因及其防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究首先建立脂筏破壞模型,確定脂筏破壞劑的合理作用時(shí)間,在不引起細(xì)胞形態(tài)及生理指標(biāo)變化的情況下,采用MTT法觀察9t18:1和9t12t18:2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TFAs對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響,進(jìn)一步通過(guò)Western-Blot分析TFAs對(duì)凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p5

5、3等)和周期相關(guān)蛋白(p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等)表達(dá)量的影響,探討脂筏對(duì)TFAs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及周期變化的影響。根據(jù)前期結(jié)果,通過(guò)Western-Blot分析脂筏上凋亡受體表達(dá),再運(yùn)用熒光顯微鏡觀察脂筏上受體變化,最后通過(guò)高效氣相色譜法分析TFAs對(duì)細(xì)胞脂肪酸組成的影響,得到反油酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的受體通路。與此同時(shí),通過(guò)以上方法和指標(biāo)對(duì)比了脂筏在不同飽和度TFAs誘導(dǎo)細(xì)胞生理變化中的介導(dǎo)作用。主要取得如下研究成

6、果:
　　1.成功建立脂筏破壞模型。脂筏破壞劑MβCD在作用濃度為10mM時(shí),其不引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力發(fā)生顯著變化的時(shí)間為60 min以內(nèi),超過(guò)60 min內(nèi)皮細(xì)胞微觀形態(tài)開始改變,甚至細(xì)胞死亡。在40 min時(shí)細(xì)胞膜膽固醇含量有明顯減低,在50 min時(shí)脂筏的標(biāo)志蛋白(小窩蛋白)表達(dá)量有顯著下降,說(shuō)明在40-60 min時(shí),MβCD即可去除脂筏又不會(huì)影響細(xì)胞的生理功能,因此確定脂筏破壞劑作用濃度為10mM,作用時(shí)間為50 m

7、in。
　　2.脂筏參與TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。TFAs可降低細(xì)胞活力,促使細(xì)胞凋亡。但TFA作用于去除脂筏的內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),細(xì)胞活力下降減少,凋亡細(xì)胞數(shù)降低,凋亡相關(guān)蛋白(caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等)表達(dá)量下降,且同濃度(50μmol/L)的9t12t18:2對(duì)上述指標(biāo)降低能力比9t18:1大,說(shuō)明脂筏參與了TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,且對(duì)9t12t18:2引起的凋亡能力更大。
　　3.脂

8、筏參與 TFAs誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變。當(dāng)脂筏功能受干擾后,9t18:1和9t12t18:2均能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期,使處于增殖期的細(xì)胞數(shù)量百分比明顯增加;對(duì)周期相關(guān)蛋白(p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等)表達(dá)量也有顯著影響。
　　4.9t18:1和9t12t18:2均能增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等炎癥因子表達(dá)量,同濃度下反亞油酸促炎效果更強(qiáng);去除脂筏后,炎癥因子表達(dá)顯著降