攜帶TAT-Apoptin重組減毒鼠傷寒沙門菌的構建及其對腫瘤細胞的作用研究.pdf

1、雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)的功能蛋白VP3可單獨激發(fā)細胞凋亡過程。因此，也被稱為凋亡素(Apoptin)。研究表明，凋亡素能選擇性誘導人肺癌細胞、黑色素癌細胞、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞凋亡，并且對正常二倍體體細胞無作用，被認為是第一個真正意義上可選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而不損傷正常細胞的凋亡蛋白。然而，天然狀態(tài)下的 Apoptin很難透過細胞膜屏障誘導腫瘤細胞凋亡，HIV-1的反式激活因子TAT具有跨

2、膜功能，能高效快速地跨膜轉運與之融合表達的蛋白并使之進入細胞，對細胞無損傷；此外，減毒鼠傷寒沙門菌可作為腫瘤基因治療的載體，能夠選擇性聚集在腫瘤組織，并且安全、可靠。
　　因此，本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌載體平衡系統構建能穩(wěn)定攜帶TAT-Apoptin基因的重組菌株?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)，感染小鼠黑色素瘤細胞B16F10和小鼠肺癌細胞LL/2后觀察分析其抗腫瘤作用，不僅可望為鼠傷寒沙

3、門菌攜帶 Apoptin的體內抗腫瘤機制提供一定的理論基礎，更重要的是可為Apoptin在腫瘤治療與應用提供新的思路與途徑。主要研究內容包括：
　　1.改良型TAT-Apoptin基因的克隆與鑒定
　　以 CAV全基因組為模板，利用 Apoptin引物先擴增出378bp左右的目的片段，連接至pMD19-T，轉化大腸桿菌JM109，挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提質粒，用限制性內切酶EcoR I和Sal I對重組載體pMD19-T-A

4、poptin進行雙酶切鑒定，電泳可見3000bp左右的載體條帶和約為378bp大小的Apoptin目的條帶；再以構建好的 pMD19-T-Apoptin為模板，利用 TAT-Apoptin引物成功擴增出411bp左右的TAT-Apoptin融合基因片段，并成功構建了重組載體pMD19-T-TAT-Apoptin。對克隆片段進行序列測定及分析后，結果顯示重組載體pMD19-T-TAT-Apoptin包含完整的Apoptin基因及TAT序列

5、，其中Apoptin基因序列與GenBank（AF199501）中發(fā)表的雞貧血病毒CAV基因序列相比同源性為99.7％。但氨基酸序列同源性為100%。
　　2.攜帶 TAT-Apoptin重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)的構建及其生物學特性
　　為構建能穩(wěn)定攜帶TAT-Apoptin的重組減毒鼠傷寒沙門菌，分別用EcoR I和Sal I對pMD19-T-TAT-Apo

6、ptin和pYA3493進行雙酶切，將所得目的片段進行連接，轉化至大腸桿菌χ6097，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定，并測序；然后將鑒定正確的陽性重組質粒 pYA3493-TAT-Apoptin電轉化至減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344，并對該重組減毒沙門菌生長特性、遺傳穩(wěn)定性和表達特性進行分析。PCR和測序表明，成功構建重組載體pYA3493-TAT-Apoptin，進一步對重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(

7、pYA3493-TAT-Apoptin)研究發(fā)現，其生長速度與強毒株 SL1344相比明顯減慢，與缺失株?crp?asdSL1344及互補菌株?crp?asdSL1344(pYA3493)基本一致，且能夠穩(wěn)定遺傳TAT-Apoptin基因，重組菌培養(yǎng)上清經SDS-PAGE能檢測到TAT-Apoptin蛋白條帶。以上結果證明，能穩(wěn)定攜帶 TAT-Apoptin的重組減毒鼠傷寒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Ap

8、optin)構建成功，且該重組菌能分泌性表達TAT-Apoptin蛋白，進一步為減毒鼠傷寒沙門菌攜帶Apoptin的抗腫瘤作用研究奠定一定的基礎。
　　3.重組減毒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)對腫瘤細胞的作用
　　將構建好的能穩(wěn)定攜帶 TAT-Apoptin的重組減毒沙門菌?crp?asdSL1344(pYA3493-TAT-Apoptin)體外感染黑色素瘤細胞B16F10和肺

9、癌細胞LL/2，利用Western-blot檢測TAT-Apoptin在不同腫瘤細胞內的表達情況，CCK-8法檢測不同MOI及感染時間條件下細胞增殖情況，流式細胞儀和TUNEL法檢測細胞凋亡情況，并進一步分析Caspase-1,3,6,8,9和細胞色素C等信號蛋白的表達情況。Western-blot結果顯示，重組菌感染B16F10和LL/2細胞后，可在細胞內檢測到約20KD的TAT-Apoptin蛋白條帶；CCK-8法實驗結果表明，MO

10、I濃度越大，抑制率越高，并且隨著感染時間的增加，抑制率逐漸下降，說明重組減毒鼠傷寒沙門菌抑制B16F10和LL/2細胞增殖具有濃度依賴性和時間依賴性；重組減毒鼠傷寒沙門菌感染B16F10、LL/2細胞24h后，熒光顯微鏡下可觀察到TUNEL陽性細胞；AnnexinV/PI流式細胞術結果發(fā)現，重組減毒鼠傷寒沙門菌感染B16F10細胞后，12h時AnnexinV+/PI+陽性率為18.3%，24h時為23.2%，感染LL/2細胞后12h，A

11、nnexinV+/PI+陽性率可達到52.2%，24h時為39.0%，均明顯高于對照組細胞，這表明重組減毒鼠傷寒沙門菌能夠誘導B16F10和LL/2細胞凋亡；進一步對凋亡信號蛋白分析發(fā)現，重組菌感染腫瘤細胞 B16F10和 LL/2后，能誘導Caspase-3，Caspase-6，Caspase-8，Caspase-9和細胞色素C的表達，互補菌對照組和細胞培養(yǎng)空白組均不能誘導上述信號蛋白的表達，此外Caspase-1在LL/2細胞中表達