攜帶NDV HN-F基因的重組減毒雞白痢沙門菌構(gòu)建及其特性.pdf

1、新城疫作為危害全球養(yǎng)禽業(yè)的烈性傳染病之一，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)劃定為A類傳染病。隨著NDV變異毒株的不斷出現(xiàn)，非典型性新城疫不斷增多，雞只免疫帶毒現(xiàn)象普遍存在，因而大大限制了傳統(tǒng)疫苗的使用。而DNA疫苗為新型新城疫疫苗的研制提供了新的思路，融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)基因作為新城疫病毒的主要保護(hù)性抗原基因，成為新城疫DNA疫苗的研究熱點。
　　目前雞白痢沙門菌仍是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要致病菌之一，傳統(tǒng)的藥物

2、治療極易造成細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。沙門菌經(jīng)基因工程減毒后，毒力顯著降低，但仍具有良好的侵襲力和免疫原性，可為該病的防控提供一定的思路。減毒沙門菌可通過自然感染途徑將真核質(zhì)粒DNA攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，從而能夠有效地刺激機體產(chǎn)生黏膜免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，作為疫苗活載體具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　因此，本研究構(gòu)建了減毒雞白痢沙門菌平衡致死真核遞呈系統(tǒng)及攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門菌株，進(jìn)一步研究了其生物學(xué)及免疫

3、學(xué)特性。
　　1.重組減毒雞白痢沙門菌平衡致死真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其特性
　　本試驗以質(zhì)粒pcDNA3.1-Zeo(+)為骨架，將氨芐抗性基因Amp替換為SD-asd基因，成功構(gòu)建無抗性基因的真核互補質(zhì)粒pcD-asd；然后將質(zhì)粒pcD-asd電轉(zhuǎn)入減毒沙門菌ΔcrpΔasdC79-13中，成功構(gòu)建平衡致死真核遞呈系統(tǒng)ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)；進(jìn)一步將egfp報告基因克隆入真核互補質(zhì)粒pcD-asd的C

4、MV啟動子下游，成功構(gòu)建重組菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-egfp)，研究該遞呈系統(tǒng)的生物學(xué)特性及其遞呈外源抗原的能力。生物學(xué)特性鑒定結(jié)果表明，重組菌株血清型與親本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致；其生化特性與親本株基本相似，但與野毒株相比發(fā)生明顯變化；生長速度較為緩慢，具有較好的體外穩(wěn)定性；重組菌株的毒力較野生株C79-13降低了約104倍；重組菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-a

5、sd-egfp)感染CEF細(xì)胞后，Western Blot結(jié)果表明成功表達(dá)了約為27 kDa的EGFP蛋白。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死真核遞呈系統(tǒng)。
　　2.攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門菌構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　本試驗將RT-PCR擴增出的HN/F基因片段插入至無抗性真核互補質(zhì)粒pcD-asd的CMV啟動子下游，分別成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒

6、pcD-asd-HN和pcD-asd-F（即pcD-asd-HN/F），然后將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入?crp?asdC79-13中，成功構(gòu)建了重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性及其遞呈HN/F蛋白的能力。試驗結(jié)果表明，該重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)的生化特性及生長特性與?crp?asdC79-13基本保持一致；重組菌株能夠在體內(nèi)體外穩(wěn)定攜帶HN/F基因

7、；重組菌株的毒力較野生株C79-13降低了約104倍；重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)感染CEF細(xì)胞后，可分別表達(dá)約為63和60 KDa的HN和F蛋白。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組NDV HN/F基因減毒雞白痢沙門菌，且能有效遞呈NDV HN/F在CEF細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3.攜帶NDV HN/F基因的重組減毒雞白痢沙門菌免疫學(xué)試特性研究
　　雛雞口服免疫重組菌株，研究其免疫學(xué)特性。結(jié)果表明，

8、重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)能夠顯著刺激雞體免疫器官的生長和發(fā)育(P＜0.05)，但對雞只體重的影響無顯著性差異(P＞0.05)；NDV抗體水平在免疫后不斷增高，3 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)，重組菌株 HN組的抗體水平較重組菌株 F組高，但組間沒有差異；沙門菌 IgG抗體水平在免疫后不斷增高，3 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)；雞消化道sIgA抗體水平在免疫后不斷增高，3

9、 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)，重組菌株 HN組的抗體水平較重組菌株 F組高，但組間沒有差異；淋巴細(xì)胞的增殖水平在免疫后緩慢增高，3 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)；IFN-γ水平在免疫后不斷增高，4 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P＜0.05)；重組菌株Δcrp?asdC79-13(pcD-asd-HN/F)對沙門菌強毒株 C79-13的攻毒保護(hù)率為100％，對 NDV強毒株 F48E8的攻毒保護(hù)率分別為70%